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人呼吸道气液界面培养的常见问题
人呼吸道气液界面培养的常见问题
本文为您系统梳理了使用PneumaCult™对人呼吸道上皮细胞（HAECs）进行气液界面（ALI）培养时的常见问题与解答。
常规信息
应该选择哪款PneumaCult™培养基？
PneumaCult™产品系列专为人呼吸道上皮细胞设计，均不含血清及牛垂体提取物（BPE）。PneumaCult™-Ex Plus培养基：适用于2D贴壁培养中原代人支气管上皮细胞（HBECs）或人小气道上皮细胞（HSAECs）的扩增培养。PneumaCult™-ALI培养基：适用于HBECs在气液界面下的分化。PneumaCult™-ALI-S培养基：适用于HSAECs在气液界面下的分化。PneumaCult™ 呼吸道类器官试剂盒：用于将HBECs分化为3D气道类器官。
了解更多有关用于呼吸道上皮细胞的PneumaCult™培养基的信息 >
- 技术窍门： 人支气管上皮细胞气液界面培养的关键操作要点
- 产品查找工具： 查找最适合您细胞培养需求的PneumaCult™培养基
在培养人气道上皮细胞（HAECs）时，PneumaCult™-Ex与PneumaCult™-Ex Plus培养基有何区别？
PneumaCult™-Ex和 PneumaCult™-Ex Plus分别是PneumaCult™产品系列中的第一代与第二代的扩增培养基。我们推荐使用PneumaCult™-Ex Plus培养基。与其他市售扩增培养基相比，该培养基可在每次传代过程中获得更高的细胞扩增能力（至少多实现2次群体倍增），并且即使经过更长时间的连续传代（至少可额外传两代），仍能保持良好的黏液纤毛分化能力。
PneumaCult™-ALI培养基和PneumaCult™-ALI-S培养基可以互换使用吗？
不可以，两款培养基无法互换。为了获得最具代表性的大气道和小气道体外模型，我们建议选用PneumaCult™-ALI培养基分化人支气管上皮细胞（HBECs），选用PneumaCult™-ALI-S培养基分化人小气道上皮细胞（HSAECs）。
对比分别在PneumaCult™-ALI-S或PneumaCult™-ALI中培养的HSAECs与HBECs的细胞形态及标志物表达（参见图3和图4） >
使用PneumaCult™-ALI培养基培养人支气管上皮细胞（HBECs）。在气液界面分化后的细胞组成比例如何？
HBECs在PneumaCult™-ALI培养基中完成气液界面分化后，通常可获得以下细胞组成：
- 基底细胞 (Basal cells)：约20% - 30%；
- 纤毛细胞 (Ciliated cells)：约50%；
- 杯状细胞 (Goblet cells)：约5% - 10%。
已有研究报道，使用PneumaCult™-ALI培养基培养的HBECs还能成功分化出离子细胞等体内罕见的特异性细胞类型。
- Scudieri P, et al. (2020) Ionocytes and CFTR Chloride Channel Expression in Normal and Cystic Fibrosis Nasal and Bronchial Epithelial Cells. Cells 9(9):2090
使用PneumaCult™-ALI-S培养基培养人小气道上皮细胞（HSAECs）。在气液界面分化后的细胞组成比例如何？
HSAECs在PneumaCult™-ALI-S培养基中完成气液界面分化后，通常可获得以下细胞组成：
- 基底细胞 (Basal cells)：约5% - 10%；
- 纤毛细胞 (Ciliated cells)：约60% - 80%；
- 棒状细胞 (Club cells)：约5% - 10%。
材料与培养基准备
应该选择哪款Transwell®插件？
在使用PneumaCult™-ALI或PneumaCult™-ALI-S培养基进行气液界面培养呼吸道上皮细胞时，我们推荐使用孔径为0.4 μm的聚酯膜插件。推荐产品如下：Costar® 6.5 mm Transwell®，0.4 μm孔径的聚酯膜插件（产品号 #38024/a>），适用于24孔板。Costar® 12 mm Transwell®，0.4 μm孔径的聚酯膜插件（产品号 #38023），适用于12孔板。上述产品均已验证可与PneumaCult™培养体系配合使用，支持获得最佳的ALI培养效果。
如何进行高通量的ALI培养？
文献研究表明，使用PneumaCult™-ALI-S培养基培养人小气道上皮细胞，并搭配HTS Transwell®-96, 0.4 µm 孔径聚酯膜插件（产品号 #100-0419），可支持最高 96 孔板规格的高通量筛选（HTS）应用。我们的内部测试表明，使用PneumaCult™-ALI培养基培养人支气管上皮细胞，并搭配HTS Transwell®-96，在96孔板中同样能够获得良好的表现。
是否需要使用胶原蛋白包被插件？
通常不需要。无论是在PneumaCult™-Ex Plus中扩增培养人气道上皮细胞（HAECs），还是在PneumaCult™-ALI/PneumaCult™-ALI-S培养基中进行分化培养，均无需对Transwell® 插件及组织培养处理的培养瓶进行胶原蛋白包被。我们的研究未发现胶原蛋白包被与未包被条件之间存在明显的培养性能差异。不过，对于部分供体来源的细胞或新鲜分离的原代细胞，胶原蛋白包被可能有助于进一步提高分化效果。
样本制备
为了建立ALI培养，官方测试过哪些供应商提供的原代气道上皮细胞？
目前市面上有多家供应商提供原代气道上皮细胞。STEMCELL对Lonza和Epithelix两家供应商的人气道上皮细胞（HAECs）进行了测试，均可成功建立稳定的ALI培养。
PneumaCult™是否支持鼻上皮细胞的培养？
虽然我们尚未在内部直接验证PneumaCult™可用于鼻上皮细胞培养，但已有多篇文献报道了该培养体系在此类细胞培养中的成功应用。
以下为使用PneumaCult™培养基培养人鼻上皮细胞的已发表文献：
使用PneumaCult™-Ex Plus培养基进行扩增：
- Villamizar et al. (2019) Targeted Activation of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Mol Ther 27(10): 1737–48.
使用PneumaCult™-ALI培养基进行分化：
- Müller L et al. (2013) Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. J Vis Exp (80): 50646.
- Cao H et al. (2015) Testing gene therapy vectors in human primary nasal epithelial cultures. Mol Ther Methods Clin Dev 2: 15034.
- Schogler A et al. (2017) Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respir Res 18(1):215.
- Garcia et al. (2019) Novel dynamics of human mucociliary differentiation revealed by single-cell RNA sequencing of nasal epithelial cultures. Development 146(20): dev177428.
- Dobzanski et al. (2018) Nasal polyp fibroblasts modulate epithelial characteristics via Wnt signaling. Int Forum Allergy Rhinol 8(12):1412–20.
分别使用PneumaCult™-Ex Plus培养基与PneumaCult™-ALI培养基进行扩增和分化：
- Eckford PDW et al. (2019) The CF Canada-Sick Kids Program in individual CF therapy: A resource for the advancement of personalized medicine in CF. J Cyst Fibros 18(1):35–43.
- Cooksley C et al. (2015) TLR response pathways in NuLi-1 cells and primary human nasal epithelial cells. Mol Immunol 68(2 Pt B):476–83.
PneumaCult™是否支持小鼠气道上皮细胞的培养？
虽然我们尚未在内部验证PneumaCult™用于小鼠气道上皮细胞培养，但已有文献报道了该培养体系在此类细胞中的应用。
以下为使用PneumaCult™-ALI培养基成功构建小鼠上皮细胞模型的已发表文献，可供参考：
- Tata et al. (2013) Dedifferentiation of committed epithelial cells into stem cells in vivo. Nature 503(7475): 218–23.
- Johnson et al. (2018) Fank1 and Jazf1 promote multiciliated cell differentiation in the mouse airway epithelium. Biol Open 7(4): bio033944.
体系建立与细胞培养
使用PneumaCult™-Ex Plus培养基扩增时，应该在何时进行传代？
H在使用PneumaCult™-Ex Plus培养基扩增人支气管上皮细胞（HBECs）和人小气道上皮细胞（HSAECs）时，建议在细胞达到50%–60%融合度时进行传代。您可以在本操作视频中（直接跳转至02:45）直接查看HBECs达到推荐融合度时的细胞形态 >
为了获得最佳分化效果，应使用第几代扩增后的HBEC建立ALI培养？
使用PneumaCult™-Ex Plus培养基扩增的早期传代细胞（即P3代/P4代）来建立ALI培养，可可获得最佳的细胞形态。虽然这一结果具有一定的供体依赖性，不同供体之间可能存在差异，但使用PneumaCult™-Ex Plus培养基培养的中后期传代细胞通常仍可形成具有假复层黏液纤毛上皮特征的分化培养物。为确保最佳实验结果，我们建议不要使用P7/P8之后的HBEC建立分化培养。
对比使用不同传代阶段的HBECs在PneumaCult™-Ex Plus中扩增并随后在PneumaCult™-ALI中进行分化的形态差异（参见图 7）>
为了获得最佳分化效果，应使用第几代扩增后的HSAE 建立ALI培养？
最佳结果通常来自P3代HSAEC。虽然培养效果同样受供体影响，但P4/P5代细胞一般仍可获得较好的分化结果。为确保最佳实验结果，不建议使用P5/P6之后的HSAEC建立分化培养。
如何判断插件内的浸没培养物，应在何时转换为气液界面（air-lift）培养？
在进行air-lift前，插件中的浸没培养必须达到100%融合度。只有当细胞达到100%融合时，它们才能均匀覆盖整个培养膜表面，形成完整且均一的单层。
您可以在本操作视频中（直接跳转至07:00）直接查看HBECs达到100%融合度、可转换为气液界面培养时的状态 >
我的接种密度高于产品说明书（PIS）的推荐值，细胞在2–4天内已达到融合，可以提前进行air-lift吗？
只要浸没培养达到100%融合度，即可进行air-lift，无需等待规定天数。
使用PneumaCult™-ALI或PneumaCult™-ALI-S建立的气液界面培养可维持多久？
使用PneumaCult™-ALI维持培养基培养的已分化的HBEC，在严格执行无菌操作并遵循推荐培养流程的情况下，可长期维持培养。我们的内部实验已成功维持培养最长达5年。使用PneumaCult™-ALI-S培养基分化培养的HSAEC，在内部实验中也可稳定培养至少6个月。
人小气道上皮细胞（HSAECs）完全分化通常需要多长时间？
通常情况下，使用PneumaCult™-ALI-S培养基培养的HSAEC在培养4–5 周后可形成完全分化的立方上皮结构。不同供体之间可能存在一定差异。
在使用PneumaCult™-ALI或PneumaCult™-ALI-S培养基维持培养期间，应何时、多久清洗一次黏液？
针对PneumaCult™-ALI培养基，建议从培养第3周开始，每周清洗一次细胞表面的黏液。若黏液积聚较多，可根据需要增加一次清洗。您可以在此ALI培养分化视频中（直接跳转至02:24）了解黏液清洗操作 >
针对PneumaCult™-ALI-S培养体系，我们通常无需进行黏液清洗。
如果培养物产生较厚的黏液层，如何提高PBS清洗效果？
若黏液层较厚，可向插件顶端室加入不含Ca²⁺和Mg²⁺的D-PBS（产品号 #37350），并于37°C孵育10–20分钟后再进行清洗。该方法有助于软化并去除较厚的黏液层。
冻存
在PneumaCult™-Ex Plus培养基中扩增的人气道上皮细胞（HAECs）可以冻存吗？是否有推荐的冻存液？
可以。在PneumaCult™-Ex Plus培养基中扩增的HAECs可进行冻存。我们建议使用CryoStor® CS10冻存液（产品号 #07930），并以1x10⁶ cells/mL的细胞密度进行冻存，以获得最佳的细胞复苏效果。
表征与鉴定
如何判断人支气管上皮细胞（HBECs）的ALI分化实验已经成功？
成功分化的HBEC ALI培养通常具有以下两项活细胞形态学特征，可作为进一步开展表征分析的参考指标：
- 在ALI培养物顶端表面可观察到纤毛规律摆动；
- 可观察到纤毛协同摆动推动分泌黏液流动的现象。
如何鉴定分别在PneumaCult™-ALI-S中构建的小气道（HSAECs）和在PneumaCult™-ALI中构建的大气道（HBECs）模型的区域特异性？
可采用以下方法评估小气道和大气道培养模型的区域特异性：
- 组织切片结合苏木精-伊红（H&E）染色，评估小气道或大气道上皮的厚度；
- 免疫细胞化学（ICC）结合荧光成像，检测区域特异性标志物的表达；
- 实时定量PCR（qPCR），分析区域相关基因的表达差异。
浏览产品页面，比较两款培养基中HSAECs与HBECs的形态学与标志物表达（参见图3和图4）>
是否有推荐的免疫细胞化学（ICC）染色的实验方案或抗体用于已完全分化的ALI培养物？
有的。您可参考相关实验方案，了解ALI培养上皮细胞免疫细胞化学（ICC）染色的具体操作步骤。以下抗体可用于气道培养物的表征分析：
| 产品名 | 产品号 # | 适用培养类型 |
|---|---|---|
| 乙酰化微管蛋白（Acetylated Tubulin） | 例如：100-0753; Sigma-Aldrich, T7451 | 大气道和小气道ALI培养 |
| Anti-Mucin 5AC抗体 | 例如：Abcam, ab212636 | 大气道ALI培养 |
| ZO-1抗体 | 例如：Invitrogen, 40-2200 | 大气道ALI培养 |
| CC10抗体 (SCGB1A1) | 例如：Santa Cruz Biotechnology, sc-365992 | 小气道ALI培养 |
| Anti-SCGB3A2抗体 | 例如：Abcam, ab181853 | 小气道ALI培养 |
是否有推荐的测量跨上皮电阻（TEER）的方案？应在何时进行测量？
有的。您可参考详细的操作方案，了解如何测定跨上皮电阻（TEER），以评估ALI培养物的上皮屏障完整性/a>。
TEER测定可重复进行，且不会对培养细胞造成损伤。因此，建议在ALI分化培养过程中每周进行一次TEER测定，以动态评估上皮屏障功能的建立过程。此外，也可在开展终点分析（如电生理检测或气道标志物表达分析）前进行TEER测定，以评估培养物的屏障功能状态。
- Bluhmki T et al. (2020) Development of a miniaturized 96-Transwell air–liquid interface human small airway epithelial model. Sci Rep 10(1):13022
沪公网安备31010102008431号