近年来，人上皮细胞的气液界面（ALI）或单层培养物作为二维（2D）模型系统，越来越多的被用于在体外研究人类健康和疾病。通过去除细胞顶端（apical）表面的培养基，气道和胃肠来源的细胞可进行进一步的分化，培养条件更接近于体内环境，更具有生理相关性。使用PneumaCult™-ALI培养基（产品号 #05001）或PneumaCult™-ALI-S培养基（产品号 #05050）培养的ALI培养体系分别表达大气道（如紧密连接和纤毛细胞）和小气道（如club细胞和分泌蛋白）的特异性细胞标志物。同样，使用IntestiCult™类器官分化培养基（人）（产品号 #100-0214）分化的肠单层和肠ALI培养物表达较高水平的关键分化标志物（如杯状细胞、肠上皮细胞和肠内分泌细胞）。

使用免疫细胞化学（ICC）染色，这是一种实验室技术，可以直观地确认细胞培养物中细胞标志物的表达和定位，研究人员可以检测相关的上皮标志物，并检查ALI和单层培养分化是否成功。除了终点表征研究，ICC染色还能让研究人员评估不同的实验条件。例如，它可以用来评估特定药物或病原体存在或不存在的情况下，培养物中的标记物表达。ICC染色也被用来显示在ALI（图2）和不同上皮组织的单层培养物上，血管紧张素转换酶2（ACE2），SARS-CoV-2病毒受体蛋白的表达。

下面的实验流程适用于：在Transwell® inserts上培养的ALI或单层培养体系的whole-mount ICC染色，包括原代细胞、多能干细胞或细胞系来源的培养体系。

实验材料

• 正常血清（Normal serum，使用与二抗相同的物种）
• 牛血清白蛋白（BSA）
• Cold fish skin gelatin
• Triton™ X-100
• TWEEN® 20
• 叠氮钠（Sodium azide，可选）
• 磷酸盐缓冲溶液（PBS；产品号 #37350）
• DAPI（产品号 #75004）
更多
• 一抗和二抗
• 甲醇
• 丙酮
• Aspirator
• Pasteur pipette
• 液体封片剂（如Prolong™Gold Antifade Mountant）
• 共聚焦或荧光显微镜
• 显微镜载玻片（如SuperFrost™ Plus Microscope Slides）
• Coverslips
• Kimwipes™
隐藏

ICC可以在ALI培养分化阶段的任何阶段进行，若要检测分化成熟的细胞，建议在ALI培养完全成熟后进行。有关人支气管上皮细胞（HBECs）、人小气道上皮细胞(HSAECs)或人肠道细胞分化的相关信息，请分别参考,PneumaCult™-ALI培养基、PneumaCult™-ALI-S培养基或IntestiCult™类器官分化培养基（人）的产品信息表（PIS）。

操作流程

I.缓冲液的制备

1. 准备100mL blocking buffer（封闭缓冲液），按表1中列出的顺序混合各组分。加入各组分后彻底混合溶液。
   • 将封闭缓冲液储存在2 - 8℃。
   表1. 封闭缓冲液的制备
   
   
   组分

   数量

   添加后溶液中的最终浓度

   PBS

   97.85 mL

   --

   Normal serum*

   2 mL

   2 %

   BSA

   1 g

   1 %

   Cold fish skin gelatin

   100 mg

   0.1 %

   Triton™ X-100

   100 μL

   0.1 %

   TWEEN® 20

   50 μL

   0.05 %

   Sodium azide**

   50 mg

   0.05 %
   * 正常血清必须与制备二抗的血清为同一物种。
   ** Sodium azide是一种抗菌剂，添加的目的是为了防止缓冲液在存放较长时间后染菌。它的毒性很强，如果快速使用（几天内），可以不添加。

2. 准备100 mL一抗缓冲液，按表2所列顺序混合各组分。加入各组分后彻底混合溶液。
   • 在2 - 8℃下储存一抗缓冲液。
   表2. 一抗缓冲液的制备
   
   
   所含组分

   数量

   添加后溶液中的最终浓度

   PBS

   100 mL

   --

   BSA

   1 g

   1 %

   Cold fish skin gelatin

   100 mg

   0.1 %

   Sodium azide

   50 mg

   0.05 %
3. 准备100 mL二抗缓冲液，按表3所列顺序混合各组分。完全混匀。
   
   表3. 二抗缓冲液的制备
   
   
   组分

   数量

   PBS

   100 mL

   Sodium azide

   50 mg
   • 在2 - 8℃下储存二抗缓冲液。
4. 准备1 mL的DAPI染色母液，按表4中列出的顺序混合成分。彻底混合并等分成50 μL的体积的溶液。
   
   表4. DAPI染色母液的制备
   
   
   组分

   数量

   PBS

   1 mL

   DAPI

   5 mg
   • DAPI染色母液的最终浓度为5 mg/mL。
   • 在-20℃下储存DAPI染色母液。



II.准备培养板

5. 将在Transwell® inserts上培养的ALI培养物从培养箱中拿出。
6. 在生物安全柜中，吸除培养基，用室温PBS洗涤ALI培养物5遍，每次5分钟。仔细吸除PBS，确保不触及培养物。
   
   
   注意事项：如果您的ALI培养物正在使用Ussing chamer进行电生理学分析，则将其拿出，并吸除Transwell® inserts上多余的缓冲液，进行下一步。
7. 将含有Transwell® inserts的板子放在冰冷（-20°C）的甲醇中，并用Parafilm®密封板子。在-20℃下孵育孔板过夜。
8. 通过快速倒置每个Transwell® inserts，并使用Kimwipe™吸干ALI培养物上可能残留的甲醇。
9. 将含有聚酯膜的插件的底部部分浸入-20℃冷的丙酮中1分钟。1分钟后，用Kimwipe™擦拭掉多余的丙酮，然后倒置晾干。干燥后，含有Transwell® inserts的培养板可保存在2 - 8°C，直到进行下一步 - 步骤III：封闭。



III.封闭

10. 用浸泡过PBS的Kimwipe™轻轻擦拭每个Transwell®插件的底部。
11. 用PBS洗涤插件（insert）3遍，每次5分钟，加入200 μL PBS到顶端和500 μL PBS到底端。每次清洗后，小心地吸除PBS。
12. 用封闭缓冲液（在第I节中制备）在室温下，孵育插件1小时。
    
    
    注意事项：板块的摇晃不是必须的，有些情况下摇晃培养板的效果更好。



IV.一抗孵育

13. 在进行一抗添加之前，用PBS洗涤每个插件3次，每遍5分钟。
14. 加入一抗，制备所需浓度的一抗缓冲液。加入200 μL 抗体缓冲液到顶端室和500 μL到基底室。
15. 在2 - 8℃下孵育过夜。
    
    
    注意事项：板块的摇晃不是必须的，有些情况下摇晃培养板的效果更好。



V.二抗孵育

16. PBS清洗插件三次，每次5分钟。
17. 吸除每个插件中的一抗缓冲液，然后用PBS再次洗涤3遍，每次5分钟。
18. 加入二抗，制备所需浓度的二抗缓冲液，一般建议二抗的稀释倍数为1：1000。加入200 μL 抗体缓冲液到顶端室和500 μL到基底室。
19. 在室温下，在黑暗中孵育插件2小时。
    
    
    注意事项：加入二抗后，避免将板子暴露在光下，以防止荧光淬灭。
    表5. 推荐的气道上皮细胞染色抗体
    
    
    产品

    产品号 #

    培养物类型

    Acetylated Tubulin

    e.g. Sigma-Aldrich, T7451

    大、小气道ALI培养

    Anti-Mucin 5AC Antibody

    e.g. Abcam, ab212636

    大气道ALI培养

    ZO-1 Antibody

    e.g. Invitrogen, 40-2200

    大气道ALI培养

    CC10 Antibody (SCGB1A1)

    e.g. Santa Cruz Biotechnology, sc-365992

    小气道ALI培养

    Anti-SCGB3A2 Antibody

    e.g. Abcam, ab181853

    小气道ALI培养
    
    
    表6. 肠道单层染色推荐抗体
    
    
    产品

    产品号 #

    Anti-human CD326 (EpCAM) antibody

    60146

    Anti-Human Chromogranin A

    e.g. BD Biosciences, 564562

    Anti-Mouse/Human Ki-67 Antibody

    e.g. Biolegend, 151202

    Lysozyme

    e.g. Dako, A0099

    Anti-Mouse E-Cadherin (CD324) Antibody

    60157; BD Biosciences, 610182



VI.封片和观察

20. PBS清洗插件三次，每次5分钟。
21. 1：1000稀释DAPI染色母液。加入200 μL DAPI缓冲液到顶端室和500 μL到基底室。
22. 2 - 8°C孵育10 -­ 15分钟。
23. PBS清洗插件，5分钟。
24. 吸除PBS，然后从Transwell® hanger（ 图1）上剥离或切割聚酯膜。从hanger上分离后，用手术剪刀剪去弯曲的膜边。这一步是为了让膜在封片时充分展开贴平在coverslip下。
    
    
    

    图1. Transwell® 插件的hanger和弯曲的膜边缘。

25. 使用Pasteur pipette，添加一滴防褪色溶液或液体封片剂到显微镜载玻片上进行封片。
    
    
    注意事项：

    • 同一载玻片不要放置超过三张培养膜。
    • 为了防止从步骤25开始的盖玻片下夹带气泡，可在一条线上加入少量的液体封片剂，以连接现有的液滴。
26. 使用镊子，将一个染色的培养膜，细胞朝上，置于液体封片剂上。膜上需加入额外的液体封片剂，使其完全覆盖膜的表面。小心地将盖玻片覆盖在培养膜上。
27. 将封片后的slide置于室温，避光过夜干燥，保持水平。
28. 在第二天，可使用共聚焦显微镜进行成像。

数据

图2. 气-液界面培养的HBECs和HSAECs表达ACE2

ALI培养物的共聚焦图像（A）在PneumaCult™-ALI培养基中培养的HBECs和（B）在PneumaCult™-ALI-S培养基中培养的HSAECs，P2代培养物。ALI培养物使用用纤毛细胞（AC-tubulin；绿色）、SARS-CoV-2受体（ACE2；洋红）和紧密连接蛋白（ZO1；红色）的抗体进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。在早期培养物（≤P6，HBECs；≤P4，HSAECs）中，（A）大气道和（B）小气道培养体系中都检测到了ACE2。在使用ALI分化之前，HBECs和HSAECs都使用PneumaCult™-Ex Plus培养基扩增。

图3. 肠单层和ALI培养物表达关键的分化标志物。

有类器官来源的单层培养体系（淹没培养）（第7天）或在ALI培养体系（第14天），均使用IntestiCult™类器官分化培养基（人），表达特异性的分化标志物。单层培养体系（淹没培养）的细胞表达肠上皮细胞（KRT20，绿色）和紧密连接蛋白（ZO-1;红色），ALI培养体系中杯状细胞（MUC2;绿色）的表达水平上升，说明分泌细胞的表达量升高。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺= 500 μm。