EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
神经诱导与分化方案设计指南
神经诱导与分化方案设计指南
引言
神经诱导是人多能干细胞（hPSCs）向神经外胚层发育的第一步。在体内发育过程中，胚胎释放的模式形成因子会解除对 TGF-β 和 BMP 信号通路的抑制，从而正式启动神经诱导机制。而对于体外培养的人胚胎干（ES）细胞和诱导多能干（iPS）细胞，需要通过在培养体系中模拟这些体内发育信号，来诱导其向神经谱系定向转化。
本技术贴旨在为您提供系统化的实操建议，协助您筛选出最理想的体外诱导方案，从而高效制备高质量的神经祖细胞（NPCs），包括培养基选择、实验方案以及进一步扩增、冻存和将 NPCs分化为下游神经细胞类型的选择。
培养基选择：STEMdiff™ 神经诱导培养基 vs. STEMdiff™ SMADi 神经诱导试剂盒
STEMdiff™ 神经诱导培养基（NIM）是一款专门用于人多能干细胞（包括人 ES 和 iPS 细胞）神经定向诱导的无血清培养基。分化生成的细胞群体主要由中枢神经系统（CNS）型神经祖细胞（NPCs）组成，并表达 PAX6、SOX1 及 Nestin 等特异性标志物。同时可能伴有少量的神经嵴细胞。若您的下游应用或实验体系不需要模式因子的干扰，STEMdiff™ NIM 将是您开展神经诱导的合适之选。
双重 SMAD 抑制 (SMADi) 通过抑制 TGF-β 和 BMP 依赖的 SMAD 信号传导，有效诱导 hPSC 的神经分化。STEMdiff™ SMADi 神经诱导试剂盒将STEMdiff™ NIM 与 STEMdiff™ 神经诱导添加物结合，能够显著提升包括低分化效率细胞系的神经诱导效率。鉴于该方法能够产生高纯度的 CNS 型 NPCs，若您后续需要将 NPCs 进一步分化为神经元或星形胶质细胞等下游细胞类型，我们强烈建议搭配使用 SMADi 添加物。
实验方案选择：拟胚体法 vs. 单层细胞法
hPSCs的神经诱导通常可采用拟胚体（EB）或单层法（Monolayer）两种培养体系来实现。这两套方案的详细操作流程均已收录在官方技术手册《使用STEMdiff™神经系统进行神经祖细胞生成与培养的技术手册》（文档号 #10000005588）中。两种实验方案各具独特优势，您可以根据具体的研究方向进行选择。请参考下表了解主要注意事项：
能有效降低不同细胞系之间的变异性
显著降低同种细胞系内各实验重复组之间的变异性
第8天检查点：显微镜下肉眼观察神经花环的形成情况。
STEMdiff™ 中脑神经元分化试剂盒（产品号 #100-0038）与STEMdiff™ 中脑神经元成熟试剂盒（产品号 #100-0041）：完全兼容。
STEMdiff™ 星形胶质细胞分化试剂盒（产品号 #100-0013）与STEMdiff™星形胶质细胞成熟试剂盒（产品号 #100-0016）：完全兼容。
BrainPhys™ hPSC 神经元试剂盒（产品号 #05795）
- 可根据实验设计自行添加额外的模式因子，以定制您的特异性神经元分化体系
相关实验方案
关键节点：hPSC衍生NPCs的表征与鉴定
完成神经诱导方案后，通过对获得的NPCs进行表征来确认诱导是否成功非常重要。尽管NPC的形态学特征可以作为评估细胞健康状况的参考，但其不足以作为判定神经诱导成功与否及细胞纯度的方法。为了评估神经诱导的效率，可以进行免疫细胞化学染色，通过以下标志物来确定有相应表达的细胞比例：
*表中所示的表达水平为常规使用 STEMdiff™ SMADi 神经诱导试剂盒时的预期结果。
建议对上述三种神经标志物中的至少两种进行染色（例如PAX6和SOX1、PAX6和Nestin，或SOX1和Nestin）。不应单独使用Nestin来评估诱导效率，因为它也可能在神经嵴细胞中表达，而神经嵴细胞是神经诱导培养中最常见的非NPC细胞类型。
若需了解如何使用流式细胞术评估神经及外胚层标志物的表达情况，请参阅以下技术指南：The STEMdiff™ Trilineage Differentiation Kit: Assessing Differentiation to Three Germ Lineages。
提升实验得率：NPCs 的扩增
在完成神经诱导后，您可以使用 STEMdiff™ 神经祖细胞培养基（NPM）对 NPC 进行持续维持与扩增。该体系可稳定传代至少 10 代以上，期间细胞能保持良好的标志物表达，且极少发生自发性神经元分化。NPC 每代可实现 3 至 5 倍的扩增数量。
NPC扩增的重要考虑因素：
- 若您的实验计划包含下游神经元分化，建议您将 NPC 在 STEMdiff™ NPM 中的传代次数严格控制在 5 代以内，以获得最佳的神经元分化效率。这并不意味着高传代数的 NPCs 完全无法用于分化；但若在高传代数细胞中观察到分化效率显著下降，建议及时更换低传代数的 NPCs 重新进行实验。
- 在进行下游分化或功能检测前，若细胞已历经多次传代，须定期对神经标志物（如 PAX6、SOX1、Nestin）的表达情况进行重新鉴定。
- 务必确保每次传代时，细胞接种密度严格达到说明书推荐的高密度（例如，至少
1.25×10⁵ cells/cm²）。高密度对于维持 NPC 的增殖状态和防止其自发分化至关重要。 - 若在传代后观察到细胞活率偏低，可在接种铺板时，在培养基中添加 10 µM ROCK 抑制剂 Y-27632。
提高实验流程灵活性：NPCs 的冻存与复苏
在实验流程的中期储存NPCs，不仅能显著提升实验灵活性，还能让您通过使用同一批初始 NPCs，从而标准化后续实验。在完成神经诱导后，您可以参照技术手册（文档号 #10000005588）第 6.3 节中的详细说明，使用STEMdiff™神经祖细胞冻存液或CryoStor® CS10对 NPC 进行冻存。
NPC 复苏的重要注意事项：
- 如果复苏后直接用于下游实验应用：
- 须将冻存的 NPC 复苏至 STEMdiff™ NPM 培养基中。细胞接种后，须先使其在原培养基中孵育一天，随后再更换为所需的下游分化培养基。
- 复苏后的接种密度可能需要根据具体应用的理想密度进行优化调整。
- 如果复苏后用于后续的 NPC 扩增培养：
- 须将冻存的 NPC 复苏至 STEMdiff™ NPM 培养基中，并持续维持培养，直至达到传代标准（通常需要 5 - 7 天）。
- 复苏时的推荐活细胞接种密度为 200,000 cells/cm²。
- 细胞复苏后，必须重新对神经标志物（PAX6、SOX1、Nestin）的表达进行表征鉴定。
- 避免对同一批细胞进行重复冻融。建议尽量在 NPC 的早期传代阶段冻存，并在后续实验中统一使用这些细胞。
- 复苏后的细胞活率通常为70-85%。若贴壁铺板后观察到 NPC 的生长状态或复苏活力不佳，可在接种时往培养基中添加 10 µM ROCK 抑制剂 Y-27632。
向神经元和星形胶质细胞分化的下游方案注意事项
若您计划将细胞进一步分化为神经元或星形胶质细胞，我们为您提供了多种培养流程方案。具体细节请参见下表：
第 12 - 13 天，或在 18 - 21 天单层神经诱导方案终点后，立即开启 STEMdiff™ 前脑神经元分化流程。具体操作请参阅STEMdiff™ 前脑神经元产品说明书（文档号 #10000005464）。
注：不建议在完成完整的 17 - 19 天拟胚体（EB）神经诱导后，再启动中脑神经元分化。
*上述备选流程方案均兼容使用 STEMdiff™ 神经诱导系统衍生出的 NPC；但与推荐流程相比，采用备选流程可能会导致下游分化效率出现一定程度的下降。
若您仍不确定哪种流程最适合您的科研项目，我们随时为您提供支持。欢迎通过电话、邮件或直接点击本页面的在线聊天与我们联系，共同探讨您的具体需求和应用场景。
参考文献
- Meyers EA et al. (2017) TGF-β Family Signaling in Neural and Neuronal Differentiation, Development, and Function. Cold Spring Harb Perspect Biol 9(8):a022244.
- Chambers SM et al. (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling, Nat Biotech 27:275—80.
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