EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
EasySep™细胞分选详细指南：技巧与提示
EasySep™细胞分选详细指南：技巧与提示
在细胞分选过程中，获得高纯度和高回收率的目的细胞是评估细胞亚型以及确保下游应用成功的关键。此外，为了尽可能地提高细胞分选效率，细胞分选的通量、速度、简便性和自动化均是此过程中需要考虑的重要因素。在众多的细胞分选方法中，磁珠分选因其快速和简便的特性成为了最常用的方法之一，其通过使用针对特定细胞表面抗原的抗体或配体来特异性地选择或去除细胞，从而分离高纯度的特定细胞亚群。
STEMCELL的EasySep™细胞分选技术将单克隆抗体的特异性与无柱磁珠系统的简便性相结合，可快速轻松地分离高纯度的细胞，为下游应用做好准备。在本文章中，我们将整合EasySep™细胞分选产品的关键注意事项和重要步骤，从而帮助您高效、便捷地完成细胞分选。
EasySep™试剂盒的储存和效期
如何储存EasySep™试剂盒
- 收到产品后请检查产品的储存说明。查看试剂盒产品说明书 (PIS) 上的“成分描述”表，以确认每个成分的建议储存方式。
- 大多数EasySep™试剂盒成分应储存在2 - 8°C下；但也存在例外，如在一些人全血正选试剂盒中使用的EasySep™ RBC裂解缓冲液（产品号 #20110）应储存在15 - 25°C下。
- 使用冷藏室或冰箱将产品储存在2 - 8°C的温度下。如果产品存放在冰箱中，则应将其放置在抽屉内或冰箱中间，以防止温度波动。请勿将试剂盒放置在冰箱后部或靠近冰箱壁的位置，因为这可能会导致试剂冻结从而损害完整性。
检查效期
在开始实验之前，请务必检查产品的效期。如果试剂盒已过期，请重新购买新的试剂盒。
提示：为了确保您的研究顺利开展，请在设计实验和检查所需材料时记录试剂的效期。
优化样本制备过程
选择适用于您样本的EasySep™试剂盒
- STEMCELL的EasySep™试剂盒已针对相应PIS中所示的特定类型和样本来源进行了优化。大多数试剂盒已使用健康供体和野生型动物组织样本进行了优化。
- 为了确保试剂盒与起始样本的兼容性，请查看试剂盒PIS中的“样本制备”部分（参见下面的示例）。 如果试剂盒与PIS中未列出的样本类型一起使用，则可能无法得到最佳的实验结果。在某些情况下，可能存在替代或优化方案；如需任何帮助，请通过info.cn@stemcell.com联系我们。
为全血样本选择正确的抗凝剂
为了达到最佳效果，我们的一些细胞分选产品在使用时需要在全血样本中加入特定的抗凝剂。您可在PIS的“样本制备”部分查看应使用的抗凝剂。如果PIS未提及抗凝剂，则在采集血样时可以使用任何的标准抗凝剂，即肝素、EDTA或ACD。
从冻存的PBMCs中分离细胞
- 使用EasySep™试剂盒从冻存的PBMCs中进行细胞分选时，细胞团块可能会影响目的细胞的回收率和纯度。为了减少细胞团块，大多数EasySep™的使用方案建议在进行细胞分选之前用DNase I孵育细胞。重要提醒：除非PIS中明确指出，否则请勿使用DNase I。
提示: 此孵育步骤使用不含EDTA的培养基或缓冲液。 - 当使用EasySep™试剂盒从冻存的PBMCs中分离细胞时，请查看PIS中的“样本制备”部分，并在进行细胞分选之前查看说明。如果PIS未提及冻存的PBMCs且未包含说明，则不建议在此试剂盒中使用冻存的PBMCs。
- 有关更多详细信息，请参阅以下实验方案：
为下游细胞分选制备细胞悬液
收集样本或组织后，您可能需要进一步处理样本，然后再进行细胞分选。如通过密度梯度离心、组织解离、从单采血小板滤器（LRSC）中回收样本等来分离PBMCs。PIS中的“样本制备”部分中包含一个简短的方案。有关更多详细信息，请查看以下详细的实验方案：
人细胞悬液：
查看这些实验方案，帮助您了解如何从全血、LRSC和白细胞单采术样本中制备人原代细胞的单细胞悬液。
确定细胞数量和细胞浓度
计数活细胞与总有核细胞（TNCs）
- 研究人员通常使用台盼蓝来确定TNCs和活细胞的数量。由于对含有红细胞（RBCs）的样本使用台盼蓝会导致难以区分有核细胞和红细胞，因此我们建议改用含3%乙酸的亚甲基蓝，其可以裂解红细胞膜和白细胞膜，将细胞核轻微地染成蓝色。由于成熟的红细胞没有细胞核，因此您可以专门对白细胞进行计数。有关细胞计数的更多详细信息，请参阅我们的实验方案和相关视频。
- 台盼蓝建议用于计数哺乳动物活细胞，其可穿透细胞膜进入细胞膜受损的细胞（死细胞）的细胞质，将其染成蓝色，而活细胞将保持未染色状态。
评估细胞回收率和制备单细胞悬液
- 在进行细胞分选之前，确定TNCs的数量并评估起始样本的活力。
- 重要：为了评估细胞回收率，需要对起始样本和分选后样本中的TNCs进行计数。请查看如何计算细胞分选后的细胞回收率和纯度部分了解更多信息。
- TNC计数不仅需要评估回收率，还需要以正确的浓度重悬细胞：
- 对于针对单细胞悬液进行优化的试剂盒，方案的第一步通常是以特定的细胞浓度重悬细胞。例如，起始样本含75 x 106个有核细胞，重悬后的细胞浓度需要为1 x 108个细胞/mL，则应使用 (75 x 106个细胞 x 1 mL) / (1 x 108 个细胞) ) = 0.75 毫升培养基重悬细胞。
选择合适的EasySep™磁极
STEMCELL用于免疫磁珠细胞分选的EasySep™磁极有多种规格可供选择，可灵活地处理不同样本量和细胞数量，以更好地用于下游应用。
重要:每个EasySep™细胞分选试剂盒只能与产品页面“磁极兼容性”下列出的EasySep™磁极一起使用（参见下面示例）。如果EasySep™试剂盒的产品页面或PIS上未列出某一磁极，则该试剂盒没有经过验证可与该磁极一起使用。欲了解更多信息，请通过info.cn@stemcell.com联系我们。
调整样本体积
每个EasySep™细胞分选试剂盒的PIS中的表格下方将列出每个特定磁极可处理的最小和最大样本量（请参见下面的示例）。
样本体积大于磁极的推荐体积
如果细胞悬液体积大于所使用的磁极的最大容量，请查看PIS并检查所有可用的方案。不同的磁极可能有经过验证的方案以适用于您的样本量。
- 如果该试剂盒与适合处理较大样本量的磁极兼容，建议改用该替代磁极以使细胞分选更有效
- 如果该试剂盒与适合处理较大样本量的磁极不兼容，或者您在实验室中无法使用该磁极，则可以将样本分成两部分，但请在添加任何试剂前分装样本并尽快进行细胞分选流程以防止延长孵育时间。
样本体积小于磁极的推荐体积
如果细胞悬液体积小于所使用的磁极的最小容量，请查看PIS并检查所有可用的方案。不同的磁极可能有经过验证的方案以适用于您的样本量。
- 如果该试剂盒与适合处理较小样本量的磁极兼容，建议使用该替代磁极。
- 如果该试剂盒与适合处理较小样本量的磁极不兼容，建议使用推荐的缓冲液将起始样本定容至当前磁极所需的最小样本容量。重要：请注意，采用此方法可能会影响细胞分选结果。
使用EasySep™成功进行免疫磁珠细胞分选的关键步骤
选择细胞分选缓冲液和培养基
为了获得最佳的细胞分选效果，请使用PIS中“推荐培养基”部分的缓冲液之一。推荐培养基通常由 EasySep™缓冲液（产品号 #20144）或含有2% FBS和1 mM EDTA的PBS组成。请参阅PIS了解更多详细信息。
不想使用含血清的缓冲液？完全没问题！
请点击此处查看替代方案。
什么情况下需要进行红细胞裂解？
请根据PIS中的说明决定是否进行红细胞裂解。例如，当使用EasySep™对小鼠脾细胞进行下游分选时，请勿在细胞分选之前进行裂红，因为这可能会对细胞回收率产生负面影响。
准备EasySep™试剂
使用EasySep™试剂盒时，应在使用前将装有磁珠（例如EasySep™ Dextran RapidSpheres™）的试管涡旋30秒，使磁珠分散均匀。重要: 不应涡旋EasySep™分选抗体混合物。
如何添加及混合EasySep™试剂
- 将试剂（例如FcR阻断剂、分选抗体混合物、磁珠等）添加到样本中时，请确保移液器枪头的末端位于液面下方，并上下吹吸2 - 3次，以确保所有试剂已添加。
- 添加试剂或缓冲液后混合样本：
使用EasySep™孵育样本
请严格遵循每个EasySep™试剂盒的PIS中描述的孵育时间和分选次数。
从EasySep™磁极中收集上清液
在细胞分选的上清液收集过程中，可根据所使用的磁极选择“倒出”或“移出”的方式。下表介绍了从每种EasySep™磁极收集上清液的正确方法。
表1.不同磁极所使用的上清液收集方式
如何计算细胞分选后的细胞回收率和纯度
细胞分选性能可以通过评估细胞回收率和纯度来确定。为了评估细胞分选性能，请使用两个样本进行比较，即起始样本与分选后的样本。简而言之，在进行细胞分选之前，从起始样本中收集一小部分；在完成细胞分选后，收集分选后的细胞样本。
如何评估细胞分选性能并检测细胞回收率和纯度。
以上就是使用EasySep™进行细胞分选的详细实验指南，希望对您有所帮助。如果您有任何疑问，请通过info.cn@stemcell.com联系我们！
沪公网安备31010102008431号