细胞计数是细胞铺板中决定细胞浓度，决定细胞活性以及评估细胞分选结果的一个重要步骤。建议在细胞分选前进行初始细胞计数，然后将其与细胞分选后的细胞计数进行比较，以计算细胞回收率。此外，当预计细胞活率可能下降时应该对活细胞进行计数，例如：当需要用到冻存的细胞或需要在体外操作细胞时。

可使用台盼蓝或含亚甲基蓝的3%乙酸对细胞进行计数。当需要计算总的有核细胞数时，推荐使用含亚甲基蓝的3%乙酸。乙酸裂解细胞膜后，亚甲基蓝对细胞核染色。而成熟的红细胞没有细胞核，因此通过此方法计数排除了红细胞。此外，推荐使用台盼蓝对活的哺乳动物的细胞进行计数。台盼蓝能穿透细胞膜，从而进入细胞膜受损的细胞（死细胞）的细胞质中，将其染成蓝色。活细胞有完整的细胞膜，能与被染成蓝色的死细胞区分。因此这种方法能对完整的活细胞进行计数。

以下操作步骤描述了如何使用含亚甲基蓝的3%乙酸对总的有核细胞计数，以及如何使用台盼蓝对活细胞计数。

实验材料

• 含亚甲基蓝的3%乙酸（产品号 #07060）或台盼蓝（产品号 #07050）
• 96孔板（如Corning®96孔圆底板，产品号 #38018）或微量离心管（如Costar®微量离心管，产品号 #38090）
• 血细胞计数板（如Neubauer血细胞计数板）和盖玻片
• 70%乙醇
• 移液枪（如Corning® Lambda™ Plus移液枪，产品号 #38060）
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• 枪头（如Corning® 过滤枪头，产品号 #38034）
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操作流程

第一部分：样本制备

方案1：使用含亚甲基蓝的3%乙酸稀释细胞以计算总的有核细胞数

1. 充分混匀单细胞悬液，并使用PBS或无血清溶液适量稀释。为了保证浓度的精确性，至少要在稀释液中加入20 µL细胞悬液。
   
   例如： 准备10倍稀释液
   
   a. 在微量离心管或者96孔板中加入180 µL含亚甲基蓝的3%乙酸。
   
   b. 细胞悬液混匀后，取20 µL加入上一步含亚甲基蓝的3%乙酸的离心管或孔中。

方案2：使用台盼蓝稀释细胞以计算活细胞数

1. 确保需要计数的细胞悬液完全重悬。在细胞沉淀前，将适当体积的细胞悬液（20 - 200μL）加入离心管中。
2. 加入相同体积的0.4%的台盼蓝，并轻轻混匀。
3. 在室温下（15°C – 25°C）孵育混合液5分钟。

第二部分：使用细胞计数板进行细胞计数

1. 使用70%的乙醇清洁细胞计数板表面，并擦拭干净。使用盖玻片盖住血细胞计数板。
2. 重悬细胞混合液，并使用20 µL的移液枪将10µL经染色的细胞滴加到血细胞计数板上。
   
   
   注意： 小心不要移动盖玻片。通过毛细作用将样本吸进计数板的腔中。
3. 将血细胞计数板置于双筒显微镜上，调节显微镜到10倍镜并聚焦到细胞上。
4. 使用手动细胞计数器，计算计数板上外面四个方格（图1A）中每个方格的细胞数（核被染色的细胞），包括计算下边和左边压线的细胞，而右边和上边压线的细胞不予计算 （图1B）。若第一步中使用的是含亚甲基蓝的3%乙酸，则对染色的细胞核计数。若第一步中使用的是台盼蓝，则对未染色的活细胞计数。
   
   
   

   图1. 血细胞计数板

   ​​血细胞计数板示意图， (A) 计数板上外面四个方格用红色表示，(B) 对其中一个方格中16个格子上的细胞进行计数。

   
   
   注意： 合适的稀释倍数取决于起始样本中大致的细胞数量，但每个方格（即大方格）中的细胞数量应在50-100个。 如果每个大方格中的细胞超过100个或少于50个，请使用更大或更小的稀释倍数重新准备稀释样本。
5. 血细胞计数板中九个大方格中的每个方格代表0.1 mm³的体积。因为1 cm³等于1 mL，细胞浓度可以用以下公式得出：
   
   
   每毫升中有核细胞总数 = 每个方格内细胞的平均数 × 细胞稀释倍数 × 10⁴
   例如： 若外面四个方格中的细胞数分别为21、15、20和17，稀释倍数为100，那么平均的细胞数为(21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18.25。
   
   因此，初始细胞悬液中的细胞总浓度为：18.25 x 100 x 104 = 18,250,000 cells/mL