神经诱导是指人胚胎干细胞（ES细胞）或诱导多能干细胞（iPS细胞）等人多能干细胞（hPSCs），向神经外胚层谱系定向分化的发育过程。神经诱导可以通过拟胚体法（EB）或单层细胞法来实现。若想获取更多技术细节以帮助您选择最适合的神经诱导工作流程，请查看 Designing Your Neural Induction and Differentiation Workflow.

本文梳理了使用 STEMdiff™神经诱导培养基（产品号 #05835）或STEMdiff™ SMADi 神经诱导试剂盒（产品号 #08581）开展单层细胞法神经诱导时的关键操作技巧与重要注意事项。完整的操作方案请参阅技术手册：Generation and Culture of Neural Progenitor Cells Using the STEMdiff™ Neural System （文档号 #10000005588）。

如果您计划选用EB法进行诱导，请参阅：Neural Induction of hPSCs Using the Embryoid Body Method.

单层细胞法神经诱导对 hPSC 的质控要求

使用高质量的人多能干细胞（hPSCs）是实现高效神经诱导的决定性前提。这意味着在您的 hPSC 培养体系中，表现出“自发分化”特征的细胞集落比例不能超过 5% - 10%。在正式启动神经诱导前，必须对所有已发生分化的区域进行精准标记并彻底清除。欢迎访问hPSC 细胞质控中心，了解更多如何科学评估并长期维持培养高质量的 hPSC。

单层细胞法神法诱导的关键步骤&技巧

• 使用前请务必将培养基预热。切勿将刚从冰箱取出的冷培养基直接加入到细胞中。
• Day 0（接种当天）：接种培养基中必须包含 10 μM Y-27632 (ROCK 抑制剂，产品号 #72302) 从而有利于单细胞状态下的 hPSCs 维持高活率。
• Day 1 - Day 6-9：在单层细胞法神经诱导方案中，细胞以极高的密度进行接种，通常在接种后的头几天内即可达到细胞融合状态。然而，有效的神经诱导至少需要在诱导培养基中持续培养 6 天以上。因此，即使细胞密度较高，也不能提前传代。请继续按照方案进行操作，让细胞进一步紧密排列。如果细胞在第6天之前开始死亡或从培养板上脱落，可以减少第0天的初始接种密度。
• Day 1 - Day 6-9：在每日换液前，观察到体系内存在部分漂浮的死细胞和细胞碎片，且培养基由于细胞高代谢而呈现黄色，这均属于正常现象。只要培养基未浑浊，且剩余的贴壁细胞依然维持着紧密排布、健康的单层状态，请继续执行该方案流程。如果需要，您可以在每日更换培养基时增加一个清洗步骤，即用含15 mM HEPES的DMEM/F-12缓冲液（产品号 #36254）进行冲洗，以更彻底地清除死细胞和细胞碎片，提升培养体系的洁净度。
• Day 6-9 - Day 18-21：请确保细胞在神经诱导培养基中连续稳定传代 3 代。完成这 3 次传代后，方可将培养体系迁移至 STEMdiff™ 神经前体细胞培养基（产品号 #05833）或进行下游的定向分化方案。如果过早使用诱导初期的细胞，可能会导致杂质细胞（如 OCT4+ 细胞）过度增殖，亦可能导致后续扩增效率低下，并削弱其向神经细胞分化的潜能。
• Day 6-9 - Day 18-21：在完成第 3 次传代并将细胞重新接种至 STEMdiff™ 神经祖细胞培养基时，务必确保达到官方推荐的接种密度（例如：至少1.25 x 10⁵ cells/cm²）。神经祖细胞（NPCs）本身具备极高的紧密排布特征。在后续培养中持续维持高密度环境，是维持其增殖活性、祖细胞态的关键条件。
• Day 6-9 - Day 18-21：通过检测NPCS的神经特异性标志物（PAX6、SOX1、Nestin）的表达情况，来评估并确证神经诱导是否成功。进行第三次传代时，可以将一部分细胞接种到较小的孔中，用于免疫细胞化学分析。欲了解更多细节，请参阅：Designing Your Neural Induction and Differentiation Workflow.

单层细胞法神经诱导的各阶段典型细胞形态学

请参考以下典型培养物形态学图片，以此直观了解在使用 STEMdiff™ SMADi 神经诱导试剂盒执行单层细胞法培养操作时，各个发育阶段对应的镜下细胞特征。

图1. 单层细胞法神经诱导的各阶段典型培养形态

(A) 神经诱导第 1 天的单层状态（10倍物镜）：接种仅 1 天后，细胞便已呈现出高密度的致密单层状态。(B) 神经诱导第 3 天的单层状态（10倍物镜）：细胞持续增殖，相互间排布得更加紧密。此时，镜下可能观察到细胞自发形成的神经花环样结构，但也可能尚未显现。(C) 神经诱导第 6 天的单层状态（10倍物镜）：细胞状态健康、密度极高，已达到首轮传代的标准。此时，镜下可能观察到细胞自发形成的神经花环样结构，但也可能尚未显现。(D) 神经诱导第 7 天状态，即首轮传代后第 1 天（10倍物镜）：细胞于第 6 天以 2 x 10⁵ cells/cm² 的密度重新接种贴壁。(E) 神经诱导第 9 天的状态，即首轮传代后第 3 天（10倍物镜）：细胞持续增殖，相互间排布得更加紧密。此时，镜下可能观察到细胞自发形成的神经花环样结构，但也可能尚未显现。(F) 神经诱导第 12 天的状态，即首轮传代后第 6 天（10倍物镜）：细胞状态健康、密度高，已达到第二轮传代的标准。此时，镜下可能观察到细胞自发形成的神经花环样结构，但也可能尚未显现。

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