一、样本制备

1. 使用密度梯度离心法（如Lymphoprep™，产品号 #18060）从全血中制备外周血单个核细胞（PBMCs）悬液。也可通过SepMate™（产品号 #85450）在15分钟内快速制备PBMCs。
2. 若样本为冻存的PBMCs，将细胞与浓度为100 µg/mL的DNase I溶液（产品号 #07900 ）在室温（15 - 25°C）下孵育至少15分钟，然后使用37 µm细胞滤筛（如产品号 #27250）过滤。
3. 使用EasySep™缓冲液将细胞以5 x 10⁷细胞/mL的浓度重悬。

二、人T细胞的分选与培养

1. 使用EasySep™人T细胞分选试剂盒从样本（步骤一中所制备）中分离人T细胞（查看产品说明书了解详情），室温（15 - 25°C）下500 x g离心5分钟。
2. 离心后使用预热（37°C）的ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养基将细胞以2 x 10⁶ - 4 x 10⁶ 细胞/mL的浓度重悬于50 mL锥型管中。
3. 将细胞置于37°C、5% CO₂的湿化培养箱中静置1小时。
   注：对于从冻存样本中分离的T细胞，建议将静置时间延长至2小时。请确保T细胞处于单细胞悬液状态后再进行下一步操作。如果此阶段细胞聚集，则不建议继续使用此供体样本。

三、制备sgRNA工作液

1. 将无核酸酶水加入sgRNA小瓶中，使终浓度达到100 μM（100 pmol/μL，参考表1）并充分混合。
   注：如不立即使用，请将sgRNA工作液分装至不含DNase和RNase的微量离心管中，可在-20°C下最多保存6个月或在-80°C下长期保存。解冻后请立即使用，请勿再次冻存。

   表1 将sgRNA重悬至100 μM

   sgRNA (nmol)

   无核酸酶水体积（μL）

   1.5

   15

   10

   100

   50

   500

四、制备CRISPR-Cas9 RNP复合物

1. 将10 mg/mL Cas9核酸酶（无甘油）、100 μM sgRNA、CellPore™递送液混合于无菌、不含DNase和RNase的微量离心管中。以下示例为单次反应所制备的RNP复合物，根据所需反应次数（包括对照反应）调整体积（参考表2）。
   注：示例为Cas9:sgRNA比例为1:2.5所需的体积。建议针对每个靶基因优化Cas9:sgRNA比例和Cas9用量。

   表2 RNP复合物的制备

   试剂	对于5 x 105 - 1 x 107个细胞		对于1 x 107 - 2.5 x 107个细胞
   	体积（μL）	添加量（pmol）	体积（μL）	添加量（pmol）
   10 mg/mL Cas9核酸酶（无甘油）	0.97	60	1.94	120
   100 μM sgRNA	1.50	150	3.00	300
   CellPore™递送液	7.53	–	5.06	–
   总计	10.00	–	10.00	–

2. 充分混匀后在室温（15 - 25°C）下孵育15分钟。如果孵育后不立即使用，请置于冰上。转染前，将RNP复合物在室温下复温5分钟。

五、转染反应混合物的制备

单个CellPore™递送管（Delivery Cartridges 300）每次反应可处理5 x 10⁵至2.5 x 10⁷个未激活的T细胞。以下示例用于制备1次反应混合物，请预留少量余量以防移液误差：

1. 预热T细胞培养基至37°C（如ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养基），可添加10 ng/mL IL-2和5%人AB血清以提高细胞活力（如有需要，可在使用前添加抗生素，如50 μg/mL庆大霉素）。
2. 对静置后的T细胞进行活细胞计数以确定细胞浓度。将每次反应所需的T细胞转移至无菌的无DNase和RNase的微量离心管中。
3. 室温（15 - 25°C）下以500 x g离心5分钟。
4. 吸出上清液并将T细胞重悬于CellPore™递送液中：
   1. 细胞数为5 x 10⁵ - 1 x 10⁷，重悬于40 µL递送液中
   2. 细胞数为1 x 10⁷ - 2.5 x 10⁷，重悬于90 µL递送液中
5. 将10 µL CRISPR-Cas9 RNP复合物添加到重悬的细胞中，上下吹打轻轻混匀（可选择同时加入CellPore™ FITC-Dextran作为阳性对照，参考表3）。
   
   

   表3 制备50或100 μL反应混合物

   Component	对于5 x 105 - 1 x 107个细胞		对于1 x 107 - 2.5 x 107个细胞
   	体积（μL）	CellPore™ FITC-Dextran体积（μL）	体积（μL）	CellPore™ FITC-Dextran体积（μL）
   T细胞悬液	40	37.5	90	85
   RNP复合物	10	10	10	10
   CellPore™ FITC-Dextran	-	2.5	-	5
   总计	50		100

六、使用CellPore™细胞转染系统将RNP复合物递送至未激活的T细胞中

1. 取一个新的CellPore™递送管，取出其中的递送插件，将适量的T细胞培养基添加到收集管中，然后将插件重新插入到收集管中。
   1. 细胞数为5 x 10⁵ - 1 x 10⁷，添加150 μL培养基
   2. 细胞数为1 x 10⁷ - 2.5 x 10⁷，添加100 μL培养基
   

   图2 将T细胞培养基预加入至CellPore™递送管的收集管中

2. 将反应混合物（50 µL或100 µL）转移到递送插件中，转移时要始终将移液器吸头尖端插入递送插件底部（请勿离心，可轻敲递送管以收集底部液体）。
   

   图3 CellPore™递送管的正确移液方法

3. 盖上盖子，并将递送管放置在CellPore™仪器的递送架上。
4. 在仪器上设置压力为70 psi，运行时间3秒，然后按下运行。
   注：对于未激活的T细胞，建议压力范围为50 - 90 psi。对于新鲜分选的T细胞，建议起始压力为70 psi。
5. 运行完成后，从仪器中取出递送管。此时细胞样本应在收集管的底部或侧面。可使用离心机离心几秒以提高回收率。
6. 弃去递送插件。
7. 盖上收集管盖子，在37°C和5% CO₂的湿润培养箱中静置孵育2小时。
   注：不建议将细胞从收集管中转移出来。静置时间少于2小时可能会导致细胞活率下降。

七、T细胞培养和激活（可选）

1. 孵育2小时后，进行活细胞计数。
2. 在T细胞培养基中以2 x 10⁶至4 x 10⁶细胞/mL的密度培养未激活的T细胞（可使用ImmunoCult™人T细胞激活剂进行激活，如产品号 #10970、#10971）。
3. 将细胞放入37°C和5% CO₂的加湿培养箱中孵育，直至下游分析。

实验数据与分析

1、确定最佳递送压力

图4 CellPore™不同递送压力下的基因敲除效率

(A) 将CellPore™ FITC-Dextran以30至110 psi的压力递送至2 x 10⁶个未激活的T细胞中。流式分析表明最佳递送压力在70至90 psi之间。(B) 将靶向B2M基因的Cas9 RNPs（25 - 60 pmol）以70或90 psi的压力递送至未激活的T细胞，培养2天后检测MHC-I敲除情况。分析 (C) CD4+和CD8+ T细胞比例以及 (D) naïve T 细胞（CD45RO- CCR7+）、中枢记忆T细胞（CM；CD45RO+ CCR7+）、效应记忆T细胞（EM；CD45RO+ CCR7-）和终末效应T细胞（TE；CD45RO- CCR7-）亚群比例以评估递送压力对T细胞表型的影响。压力越高，naïve T细胞的损失越大。数据以平均值±标准差表示，n = 3 - 13。

2、确定转染混合物的最佳递送条件

图5 CellPore™在不同CRISPR-Cas9 RNP比例和剂量下的基因敲除效率

评估不同Cas9 RNP组成和剂量对MHC-I基因敲除的影响。(A) 将Cas9核酸酶与靶向B2M的sgRNA以不同的比例组合。然后将RNP复合物以90 psi的压力递送至2 x 10⁶个未激活的T细胞中，并通过流式细胞术评估MHC-I基因敲除效果。当Cas9:sgRNA的比例为1:2.5时，可达到稳定的敲除效果。 (B) 将来自3家供应商的Cas9核酸酶与B2M sgRNA以1:2.5的比例复合，并以40至100 pmol RNPs的剂量递送。(C) 对来自同一家供应商的Cas9 RNPs进行比较以评估其对甘油的敏感性。在测试剂量范围内，无甘油Cas9配方在未激活T细胞中可实现更高的编辑效率。数据以平均值±标准差表示，n = 1 - 13。

3、高效的基因敲除效率

图6 CellPore™细胞转染系统可对未激活的T细胞实现高效的CRISPR-Cas9基因敲除

将靶向 (A, B) B2M或 (C, D) TRAC基因的Cas9 RNP（Cas9:sgRNA比例为 1:2.5）以 90 psi的压力递送至一系列未激活的T细胞中（0.5 - 25 x 10⁶）。使用流式细胞术评估细胞活率和表面MHC-I（培养2天后）或TCRαβ（培养6天后）的敲除效率。结果表明，CellPore™转染系统可在保持T细胞高活率的情况下实现高敲除效率。Scramble组为递送非靶向Cas9 RNP，M = 百万，数据以平均值±标准差表示，n = 3。

4、保留T细胞的未激活表型

图7 CellPore™细胞转染系统可保留T细胞转染后的未激活表型

使用CellPore™转染系统或电转处理24-48小时后，对未激活的T细胞进行分析。(A) 从3位供体的培养上清液中检测21种促炎细胞因子和趋化因子的浓度。结果显示，CellPore™处理的细胞与未处理的对照细胞具有相似的细胞因子谱，而电转样本检测出多种促炎细胞因子（如 IFNγ、IL-2、TNF-α）和趋化因子（如MIP-1α、MIP-1β）的水平升高。(B) 通过RT-qPCR进一步证实了这一结果，相对于未处理的对照细胞，电转样本中的IFNγ和IL-2 mRNA转录本显著增加。此外，(C) 电转样本在2天后表现出早期T细胞激活标志物（CD69）显著增加。相比之下，CellPore™处理的未激活T细胞与未处理的对照细胞相似。数据以平均值±标准差表示，n = 3。

图8 CellPore™细胞转染系统可维持未激活T细胞的激活和扩增能力

使用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂和含人重组IL-2的ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养基扩增经基因编辑的T细胞。首先使用CellPore™转染系统或电转将60 pmol B2M Cas9 RNP转染至未激活的T细胞中。2小时后，1 x 10⁶个T细胞被激活，并进行为期10天的扩增。(A) 流式细胞术分析表明CellPore™处理的T细胞与未处理的T细胞具有相似的CD25标志物表达。(B) 第10天的总扩增倍数表明，CellPore™处理的T 细胞与电转细胞具有相似的扩增水平。此外，(C) 通过流式分析MHC-I表面标志物的表达，证实了CellPore™处理的T细胞在整个扩增期内具有持续的基因敲除效率。(D) 培养10天后，可获得高回收率的T细胞。这些结果表明，CellPore™转染系统能够高效地将基因编辑复合物递送至未激活的T细胞，并保留激活和扩增能力，同时维持基因敲除效果。数据以平均值±标准误差表示，n = 5。

进一步的优化技巧

1. 本方案不建议使用激活的人T细胞。
2. 本方案适用于从冻存的PBMCs中分离的T细胞。
3. 从存放时间较长的PBMCs或白细胞单采术样本（>48小时）中分离的细胞可能细胞活率较低。基因编辑结果可能因供体而异。
4. 使用冻存样本时，请迅速彻底地从解冻的细胞悬液中洗去冷冻保护剂（例如DMSO）。
5. 如果在T细胞分选前观察到细胞聚集，建议使用37 µm细胞滤筛（如产品号 #27250）过滤细胞悬液以获得最佳结果。如果在T细胞分选后观察到细胞聚集，则不建议继续实验。
6. 减少细胞在室温下的暴露时间，进行大规模实验时，请考虑将未使用的细胞培养在37°C和5% CO₂的加湿培养箱中。
7. 为了在未激活的T细胞中获得最佳编辑效率，可能需要筛选向导RNA (sgRNA)。设计向导RNA时，建议尽可能选择与目的基因转录起始位点对齐的序列。
8. 为了获得最佳性能，建议使用不含甘油的Cas9核酸酶配方。
9. 为了获得最佳编辑效率，可能需要对Cas9 RNP进行滴定。同样，也可能需要对Cas9:sgRNA的比例（从1:1到1:8）进行滴定。
10. 降低递送压力可以提高T细胞亚群的比例，并改善其在某些下游应用中的功能。然而，这可能会导致编辑效率降低。
11. 使用CellPore™转染系统的最低反应体积需要50 µL。
12. 为获得最佳结果，每次反应添加的目的物质总量不应超过CellPore™递送液体积的10%。
13. 为确保结果准确，请添加对照组，例如仅含Cas9、仅含sgRNA、scrambled sgRNA、不含物质的模拟转染以及未处理的样本。