脑类器官是体外3D模型，其细胞组成和结构组织能代表发育中的人脑。使用STEMdiff™脑类器官试剂盒可从人多能干细胞（hPSC）诱导生成脑类器官，整个过程基于Madeline Lancaster发表的实验流程^1,2并经过优化，用以提高类器官的生成效率和实验重现性。该流程描述了如何从hPSC诱导生成脑类器官，这些脑类器官具有明显的边界，紧密的细胞排列，和小于10％的分化区域。

实验前准备： 无菌条件下准备STEMdiff™脑类器官培养基。在室温（15 - 25°C）下解冻STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplements，混合均匀。如果不立即使用，将添加物分装，并在-20℃下保存。注意在产品有效期内使用添加物。分装后的培养基重新解冻后，需马上使用。切忌反复冻融。

第一阶段：类胚体的形成（第0-5天)

实验材料

• STEMdiff™脑类器官试剂盒（产品号 ＃08570）
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement A
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 1
• D-PBS（不含Ca++与Mg++）（PBS，产品号 #37350）
• 枪头（如Corning® Filtered Pipette Tips，产品号 #38034）
• 移液枪（如Corning® Lambda™ Plus Pipettor，产品号 #38058）
• 温和细胞解离试剂（GCDR，产品号 #07174）
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• 50 mL离心管（如Falcon® Conical Tubes，50 mL，产品号 #38010）
• Y-27632（产品号 #72302）
• 96-well round-bottom ultra-low attachment plate（如Corning 产品号 #7007））
• 多通道移液器（如Corning® Lambda™ Plus Multi-Channel Pipettor，产品号 #38064）
• 培养器皿（如35 mm Culture Dishes，产品号 #27100）
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操作流程

第0天

1. 准备EB Formation Medium，将10 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement A到40 mL的 STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 1中。
2. 使用显微镜观察确定分化的区域。通过用移液管尖端刮擦或通过抽吸去除分化区域。
3. 吸除培养基，使用PBS润洗细胞。
4. 吸去润洗液，加入1 mL的GCDR。
5. 37°C孵育8 -­ 10分钟。
   
   
   注意事项： 请注意对于不同的细胞系或者使用不同的无酶细胞传代试剂，孵育时间也会有所不同。
6. 使用1 mL移液枪，轻轻重悬细胞，上下缓慢吹打3 - 5次。将细胞悬液转移至50mL离心管中。
7. 制备EB Seeding Medium，在EB Formation Medium中加入10 µM的Y-27632。
8. 加入1 mL EB Seeding Medium润洗培养孔，一并加入离心管中。
9. 300 x g，离心5分钟。
10. 弃去上清。加入1 - 2 mL的EB Seeding Medium重悬细胞。
11. 使用台盼蓝（Trypan Blue）和细胞计数板进行细胞计数。
12. 计算获得90,000个细胞/mL所需的细胞体积；将此体积的细胞添加到适当体积的EB Seeding Medium中。
13. 在96-well round-bottom ultra-low attachment plate的每孔加入步骤12中制备的100 μL细胞悬浮液（9000个细胞/孔）。
    
    
    注意事项： 为了提高EB的形成效率和重现性，建议使用多通道移液器进行此步骤。
14. 在37℃下孵育96孔板。24小时内不要移动培养板。24小时后，应观察到小EB的形成（直径100 - 200 μm左右）。

第2 - 5天

1. 在第2天和第4天，每孔加入100 μL的EB Formation Medium。这一步建议使用多通道移液器。37℃下培养。
2. 第5天，在显微镜下观察EBs。EB的直径应大于300 μm(通常为400-600 μm)，并表现出圆形和光滑的边缘。这些EBs可以进行第二阶段的操作。

第二阶段：诱导分化（第5-7天）

实验材料

• STEMdiff™脑类器官试剂盒（产品号 #08570）：
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement B
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 1
• 24-well ultra-low attachment plate（如Corning® 产品号 #3473）
  • 注意事项： 如果没有ultra-low attachment plate，可使用 Anti-Adherence Rinsing Solution（产品号 #07010）对普通的 tissue culture-treated cultureware进行预处理，降低细胞黏附。
• 移液枪（如Corning® Lambda™ Plus Pipettor，产品号 #38059)
• Wide-bore 200 μL枪头

操作流程

第5天

注意事项： 实验开始前需预热培养器皿，培养基和其它实验试剂到室温（15 - 25℃）。

1. 准备Induction Medium，将0.5 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement B到49.5 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 1中。
2. 在24-well ultra-low attachment plate的每孔加入0.5 mL Induction Medium。
3. 在24孔板中每孔加入1 - 2个EBs，如下:
   
   a. 使用wide-bore 200 µL枪头，从96孔板（第一阶段）中每孔吸取50 µL液体获取EB。
   
   b. 小心的移除将大部分液体，将EB留在枪头内。
   
   c. 将EB分配到含有Induction Medium的24孔板中。
   
   
   注意事项： 在孵箱中前后晃动培养板3 - 4次，将EB均匀的分布在孔中。接触到一起的EB更容易合并。如果合并的EB数量较多，则每孔只加入一个EB。
4. 37℃孵育48小时。在Induction Medium中生长两天后，EBs应该是肉眼可见的（直径500 - 800 μm左右），并具有光滑，半透明的边缘。这说明神经上皮的形成。这些EBs可以进入第三阶段的培养。

第三阶段：扩张（第7 - 10天）

实验材料

• STEMdiff™脑类器官试剂盒（产品号 #08570）：
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement C
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement D
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 2
• Corning® Matrigel® hESC-Qualified Matrix （Corning® 产品号 #354277）
• Organoid Embedding Sheet（产品号 #08579）
• Sterile 100 mm dish（如Culture Dish，Non-Treated，产品号 #38045）
• 移液枪（如Corning® Lambda™ Plus Pipettor，产品号 #38059）
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• Wide-bore 200 μL pipette tip
• Standard 200 µL pipette tip
• Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture (产品号 #38071）
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操作流程

第7天

1. 将Matrigel®在2 - 8°C，冰上解冻1 - 2小时。
   
   注意： 解冻足够的Matrigel®，保证每个EB具有15 μL Matrigel®（如96孔x 15 μL/孔= 1.44 mLMatrigel®）。将Matrigel®保存在冰上，以防止过早凝固。所有与Matrigel®接触的塑料器皿在使用前应在-20°C下至少冷冻30分钟。
2. 准备Expansion Medium，将0.25 mL STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement C和0.5 mL STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement D加入24.25 mL STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 2中。
3. 在一个无菌的100 mm培养皿中加入一片无菌的Organoid Embedding Shee。
   
   
   注意事项： 也可以用Parafilm®创建一个embedding sheet。
4. 使用wide-bore 200 µL枪头，从24孔板的一个孔中吸取25 - 50 μL的培养基+EB，并转移到embedding sheet上。重复此步骤，直到将12 - 16 EBs放入embedding sheet。
   
   
   注意事项： 每次操作不超过12-16个EB；这将防止EB干燥和Matrigel®过早凝固。
5. 使用一个标准的200 µL枪头，吸除除每个EB外多余的培养基。枪头朝向EB的另外一侧，避免接触到EB。
6. 使用带有200 µL标准枪头的移液枪，每个EB上加入15 µL Matrigel®。
7. 使用一个新的冷的200 µL移液器吸头，重新将EB定位到液滴的中心。
8. 37°C孵育30分钟，等待Matrigel®凝固。
9. 使用无菌镊子提起含有Matrigel®凝固液滴的embedding sheet。
10. 将embedding sheet对准一个6-well ultra-low adherent plate的一个培养孔。使用1 mL移液枪，吸取Expansion Medium并轻轻地将Matrigel®液滴从embedding sheet上冲到培养孔中。每孔使用3 mL Expansion Medium。重复上述步骤，每孔可培养12 - 16个Matrigel®包埋的类器官。
11. 37℃下孵育3天。包埋的类器官会发育扩展生成神经上皮结构，在EB表面表现为出芽状。这些EBs可开始进行第四阶段的培养。

第四阶段：类器官成熟（第10 - 40+天）

实验材料

• TEMdiff™脑类器官试剂盒（产品号 #08570）：
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement E
  • STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 2
• mL或10 mL移液管（如Falcon® Serological Pipettes，5 mL 产品号 #38003或Falcon® Serological Pipettes，10 mL，产品号 #38004）

操作流程

第10天

1. 准备Maturation Medium，将2 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement E加入98 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 2中。
2. 使用5 mL或10 mL的移液管，轻轻的吸除培养孔中的培养基。不要碰到Matrigel®包埋的类器官。
3. 每孔更换3 mL新鲜的Maturation Medium。
4. 将含有类器官的培养板置于37°C孵箱的水平摇床上。INFORS HT Celltron orbital shaker，按照表1调整转速（rpm）。对于其他摇床型号，请使用以下公式计算转速。
   
   表1. INFORS HT Celltron Orbital Shaker的推荐摇床速度，适用于各种培养器皿
   
   
   培养器皿*

   培养基体积（mL）

   推荐的转速（rpm）

   相对离心力（RCF）^† (g)

   6-well plate
   60 mm dish

   3.0

   65

   0.11808

   12-well plate

   1.5

   85

   0.20194

   24-well plate

   1.0

   100

   0.27950

   *我们推荐使用6孔板或12孔板。

   ^†Calculated using throw (shaking diameter) of 25 mm for the INFORS HT Celltron.

   
   
   其中：
   rpm=转速（每分钟转数）
   RCF=相对离心力(g)，表2中提供了各种培养器皿的相对离心力。
   throw = shaking diameter (mm), as specified by manufacturer
5. 每隔3 - 4天进行一次全换液，具体如下：
   
   a.倾斜培养器皿。
   
   b.使用5 mL移液管慢慢吸除培养基。
   
   c.加入3 mL/孔的新鲜培养基。
   
   d.将培养板置于37°C孵箱的水平摇床上。
6. 在Maturation Medium中培养30天后，类器官会长到3 - 4 mm的大小。
   • 第10天：器官显示萌芽形态，说明神经上皮的扩张。
   • 第15天：扩张的神经上皮出芽合并，类器官形成一个致密的中心。
   • 第20天：类器官的直径将超过750 μm；可观察到小的神经花环状结构。
   • 第30天：类器官直径超过1 mm，并显示出带有致密中心的组织结构。
   • 第40天：类器官的直径约为3 - 5 mm。这时，类器官中心部位致密且深，并具有皮层细胞的分布。发育不好的类器官没有形成清晰的边界、大小上在培养至40天时也会小于1 mm。PAX-6+的祖细胞被发现位于脑室带样区域存在，并且明显与TUJ-1+的神经元分开。
7. 0天后，可使用STEMdiff™脑类器官成熟试剂盒（产品号 ＃08571）继续培养脑类器官。