以下操作步骤描述了如何使用RosetteSep™从全血中分离细胞。RosetteSep™是一种通过密度梯度离心分离特定细胞亚群的免疫密度细胞分选平台。RosetteSep™首先将不需要的细胞与样本中的红细胞（RBC）交联，形成免疫玫瑰花结构（immunorosettes）。免疫玫瑰花结构在密度梯度离心过程中会沉淀，使高纯度的目的细胞留在血浆和密度梯度离心液之间的界面。下述为使用RosetteSep™抗体混合物分离特定细胞类型的常规实验步骤；具体的实验条件根据需要富集的细胞类型可能有所不同。

实验材料

• 全血样本
• 用于您目的细胞亚群的RosetteSep™抗体混合物
• 含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS+2%FBS，如含2%胎牛血清的Dulbecco's磷酸盐缓冲液，产品号 #07905）
• 密度梯度离心液（如Lymphoprep™，产品号 #07801）

操作流程

1. 在样本中加入RosetteSep™混合物并混合均匀。室温下（15-25℃）孵育20分钟。
2. 用等体积的PBS+2% FBS稀释样本并轻轻混匀。将稀释的样本加于密度梯度离心液之上（推荐使用的样本和密度梯度离心液体积请见表1）。请注意尽量避免密度梯度离心液和样本混在一起。
   
   表1. 用于免疫密度细胞分选的推荐的体积和试管容量
   
   
   样本体积 (mL)

   试管容量 (mL)

   PBS + 2% FBS (mL)

   密度梯度离心液 (mL)

   1

   5

   1

   1.5

   2

   14

   2

   3

   3

   14

   3

   3

   4

   14

   4

   4

   5

   50

   5

   15

   10

   50

   10

   15

   15

   50

   15

   15
   
   
3. 在室温下1200 x g离心20分钟，关闭刹车。
   
   小窍门：使用SepMate™可将离心时间缩短至10分钟（开启刹车）。
4. 从密度梯度离心液和血浆之间的界面收集富集的细胞。加入PBS+2% FBS清洗细胞，并重复此步骤。
   
   
   注意：有时会较难分辨中间界面的细胞，特别是在富集稀有细胞时；在这种情况下，可采用以下方法以最大化回收率。
   最大化回收稀有细胞的操作步骤：
   
   a. 收集富集的细胞的同时收集一些密度梯度离心液。
   
   b. 加入PBS + 2% FBS。300×g离心10分钟，低速下开启离心机刹车。弃去上清液。重复上述步骤。富集的细胞可立即用于下游应用。