星形胶质细胞占脑细胞总数的很大一部分，在离子稳态、神经元功能、突触传递、血脑屏障完整性和损伤反应中起着关键作用。在体内发育和体外分化过程中，星形胶质细胞比神经元晚出现，并对神经回路的发育起重要作用1。为了在体外模拟相关的神经细胞间的相互作用，往往需要对星形胶质细胞与神经元进行共培养。该实验流程描述了如何通过分别从人多能干细胞(hPSCs)中获得前脑型神经元和星形胶质细胞，二者在共培养中，在二维的培养体系中可重现复杂的细胞间相互作用。

实验材料

• STEMdiff™前脑神经元分化试剂盒（产品号 #08600）
• STEMdiff™前脑神经元成熟试剂盒（产品号 #08605）
• STEMdiff™星形细胞分化试剂盒（产品号 #100-0013）
• STEMdiff™星形胶质细胞成熟试剂盒（产品号 #100-0016）
• STEMdiff™ SMADi神经诱导试剂盒（产品号 #08581）*✝
• Poly-L-ornithine hydrobromide (PLO)（Sigma P4957）*
• Laminin (Sigma L2020) *
查看更多
• Corning® Matrigel® hESC-Qualified Matrix（Corning® 产品号 #354277）✝
• DMEM/F-12 with 15 mM HEPES（e.g. 产品号 #36254）*✝
• Tissue culture-treated cultureware (如产品号产品号 #38015和/或#38017）
• ACCUTASE™（产品号 #07920/07922）
• 台盼蓝（如产品号 #07050）
• 细胞计数板
隐藏

* 前脑型神经元分化所需，STEMdiff™前脑神经元产品信息表中有述。

✝ 星形胶质细胞分化所需，STEMdiff™星形胶质细胞产品信息表中有述。

操作流程

图1. hPSC来源的前脑神经元与星形胶质细胞共培养实验流程

hPSCs被独立分化为前脑型神经元和星形胶质细胞，然后在优化的实验条件下进行共培养。

第一部分：将hPSCs分化为星形胶质细胞

1. 参考STEMdiff™ Astrocyte PIS中的实验流程。
2. 分化结束后，在STEMdiff™星形胶质细胞成熟培养基中培养至少3周，直至星形胶质细胞完全成熟。
3. 通过对培养的细胞亚群进行免疫学染色，验证星形胶质细胞分化是否成功：
   
   
   注意：常规使用STEMdiff™星形胶质细胞系统时，细胞群应> 70% S100ꞵ⁺，> 60% GFAP⁺，且 < 15%为ꞵ-III-tubulin或doublecortin（DCX）阳性。

第二部分：将hPSCs分化为前脑神经元

1. 参考STEMdiff™ Forebrain Neuron PIS中的实验流程。
   
   
   注意：将神经元前体细胞接种到STEMdiff™前脑神经元成熟培养基（PIS第1步C节）中时，建议的接种密度为1.5 × 10⁴ - 6 × 10⁴个细胞/cm²，具体取决于下游应用和预期的培养时间。最佳密度应由用户确定。
2. 分化结束后，在STEMdiff™前脑神经元成熟培养基中培养至少1周，直至前脑神经元完全成熟。
3. 通过对培养的细胞亚群进行免疫学染色，验证前脑神经元分化是否成功：
   
   
   注意：常规使用STEMdiff™前脑神经元系统，细胞群应 > 90%阳性ꞵ-III-tubulin 和 FOXG1，< 10% GFAP⁺。

第三部分:建立神经元-星形胶质细胞共培养

1. 根据STEMdiff™ Astrocyte PIS C 节（星形胶质细胞成熟）的步骤 1-5，将第一部分得到的星形胶质细胞解离出来。
   
   
   注意：在适当体积的完全STEMdiff™星形胶质细胞成熟培养基中重新悬浮细胞，并使用台盼蓝和细胞计数板进行计数。
2. 在其他完全的STEMdiff™星形胶质细胞成熟培养基中稀释细胞悬液，以获得所需的细胞浓度和体积。
   
   
   注意：星形胶质细胞悬液的浓度和体积应由用户优化，并将取决于所需的星形胶质细胞与神经元的细胞类型比、使用的培养孔数以及第二部分中铺板的前脑神经元前体的初始细胞密度。推荐的星形胶质细胞与神经元的比例在2:1到6:1之间。
3. 吸除第二部分中前脑神经元的培养基上清。
4. 将第2步中制备的星形胶质细胞接种到前脑神经元上。
5. 1天后，更换培养基为新鲜的STEMdiff™前脑神经元成熟培养基。
6. 37°C，5% CO₂，进行共培养。每隔2-3天，使用STEMdiff™前脑神经元成熟培养基进行全换液。在分析前，共培养可维持至少1-2周。