肠器官是3D细胞培养物，再现了成人肠上皮的细胞特性和组织。肠类器官培养物的一个关键好处是，可以对它们进行基因组编辑，如通过CRISPR-Cas9，这是一种RNA引导的技术，由于它的便宜性和高效率，已经彻底革新了基因组编辑。将CRISPR-Cas9和类器官相结合，可以让研究人员开发出更多生理相关的体外人类疾病模型，研究器官发育。

下面，我们描述了对在类器官生长培养基（人）（产品号＃06010）中培养的人肠类器官进行CRISPR-Cas9基因组编辑的操作流程，使用ArciTect™CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）为基础的系统和STEMCELL的Guide RNA Design Tool。

实验材料

• ArciTect™ Cas9 Nuclease*（产品号#76002 / 76004）
• ArciTect™ sgRNA^†（产品号#200-0013）:
• IntestiCult™类器官生长培养基（人）（产品号#06010)
  • IntestiCult™ OGM Human Basal Medium, 50 mL（原 IntestiCult™ OGM Human Component A）
  • Organoid Supplement, 50 mL（原IntestiCult™ OGM Human Component B）
• DMEM/F-12 with 15 mM HEPES（产品号#36254)
• 25%牛血清白蛋白（BSA），溶于磷酸盐缓冲液（PBS）
• 低生长因子、无酚红的Corning®Matrigel®基质（Corning 356231）
• D-PBS（不含Ca++与Mg++）（产品号#37350）
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• ACCUTASE™（产品号#07920 / 07922）
• Y-27632（产品号#72302 / 72304 / 72307 / 72308）
• Neon® Transfection System 10 μL Kit（Thermo Fisher MPK1025）
  • 重悬缓冲液T（Resuspension Buffer T）
  • 电解缓冲液E（Electrolytic Buffer E）
  • 10 μL Neon®移液枪枪头
  或
  P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit S（Lonza® V4XP-3032)
  • 16-well Nucleocuvette™ Strips
  • P3 Primary Cell Nucleofector™ Solution
  • Supplement 1
• Costar® 24孔平底板，Tissue Culture-Treated（产品号#38017）
• 不含DNase和RNase的微量离心管（产品号#38088）
• Falcon®锥形管，15 mL（产品号#38009）
• Falcon®圆底试管，带细胞过滤器盖，5 mL（产品号#38030）
• 无核酸水（产品号#79001）
• 70 μm Reversible Strainer（产品号#27216）
• 庆大霉素（Gentamicin）
• 37°C水浴或heat block

也可以使用ArciTect™ Cas9-eGFP Nuclease（产品号#76006）或ArciTect™ Cas9 Nickase（产品号#76009）。

†所有测试均使用ArciTect™ Cas9 Nuclease进行。†本产品仅在澳大利亚、奥地利、比利时、加拿大、中国、丹麦、芬兰、法国、德国、冰岛、爱尔兰、卢森堡、荷兰、新西兰、挪威、波兰、葡萄牙、新加坡、西班牙、瑞典、瑞士、英国和美国销售。

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有关使用 IntestiCult™ 类器官生长培养基（人）培养和传代人肠类器官的信息，请参阅产品信息表（文档号#DX21423）。

所需材料以每孔为单位表示。这些数值需要根据实验中的实际孔数进行调整。靶向一个新基因时，通常会测试多个指导RNA（gRNA）靶向序列，因为不同的gRNA可以在靶向和非靶向位点表现出一系列的靶向/编辑效率。单一的引导RNA（sgRNA）可以使用STEMCELL的Guide RNA Design Tool进行设计。该工具采用最佳实践和最新的计算工具，为人类和小鼠基因组中的每一个基因设计最佳靶向序列。

操作流程

第一部分:ArciTect™ sgRNA工作液的制备方法

1. 打开所有的试剂前简单离心。
2. 按照表1，加入无核酸酶水制备终浓度为100μM single guide RNA （sgRNA）的试剂。
   
   

   表1. 100μM*ArciTectTM sgRNA的重悬液体积

   ArciTect™ sgRNA	无核酸酶水体积（µL）
   4 nmol	40

   *100 μM为100 pmol/μL

3. 完全混匀。如果不立即使用，可进行分装，并在-20℃下保存6个月，或在-80℃下保存6个月以上。解冻后，应立即使用。切忌反复冻融。

第二部分:完全IntestiCult™类器官生长培养基（人）和DMEM+1%BSA的制备方法。

无菌条件下制备完全IntestiCult™类器官生长培养基（Human Basal Medium<基础培养基> + Organoid Supplement<添加物>）。下面的示例是配置500 mL的完全培养基。如需制备不同体积，可根据以上比例调整。

1. 在室温（15 - 25°C）或在2 - 8°C下过夜解冻Human Basal Medium & Organoid Supplement。完全混匀。
   
   
   注意事项： 解冻后须立即使用，或分装储存于-20°C（最长储存3个月）。分装后的培养基重新解冻后，需马上使用。切忌反复冻融。
2. 混合50 mL的Organoid Supplement和50 mL的Human Basal Medium。完全混匀。
   
   
   注意事项： 如果不立即使用，可在2 - 8°C最多存储1周。
3. 使用前立即加入所需的抗生素（如50 µg/mL庆大霉素或100单位<100 µg/mL>青霉素/链霉素）。

使用无菌技术制备DMEM + 1％BSA。下面的例子是用于制备50 mL的DMEM+1%BSA。如需制备不同体积，可根据以上比例调整。

1. 在50 mL锥形管（如产品号＃38010）中加入2 mL 25％BSA和48 mL DMEM/F-12 with 15mM HEPES。
2. 用倒置法搅拌均匀。置于冰上。
   
   
   注意事项： 如果不立即使用，可在-80°C下保存最多6个月。

第三部分:用于电穿孔的肠类器官单细胞悬浮液的制备方法

1. 在进行Matrigel铺板前，在37°C的培养箱中预热24孔组织培养板至少2小时。
   
   
   注意事项： 解冻后须立即使用，或分装储存于-20°C（最长储存3个月）。分装后的培养基重新解冻后，需马上使用。切忌反复冻融。
2. 预热完全IntestiCult™类器官生长培养基（人）至室温。
   
   
   注意事项： 每个培养孔（需进行电穿孔），将需要750 µL的培养基。
3. 在冰上解冻Matrigel®。
   
   
   注意事项： 对于每个待铺板的培养孔（需进行电穿孔），需要25 µL Matrigel®。
4. 将DMEM + 1％BSA置于冰上。
5. 每孔准备1 mL ACCUTASE™ + 10 µM Y-27632，用于消化类器官。预热至室温。
6. 小心地从每个孔中吸出培养基，不要触碰Matrigel® dome。
7. 在每个孔中的dome上加入500 µL ACCUTASE™ + 10 µM Y-27632。室温（15 - 25°C）孵育1分钟。
8. 用DMEM + 1% BSA预先润湿1 mL移液枪枪头；使用该枪头彻底打散Matrigel® dome，并清洗孔壁。上下吹打2 - 3次，打碎dome和类器官。确保所有Matrigel®的碎片都已从孔壁上冲洗干净。
9. 使用相同的枪头，将类器官混合物转移到一个不含DNase和RNase的微量离心管中。
   
   
   注意事项： 如果从多孔收集类器官，将混合物转移到一个15 mL Falcon® tube（产品号#38009）。
10. 在同一孔中加入500 µL ACCUTASE™ + 10 µM Y-27632，并使用预先润湿的枪头收集剩余的Matrigel®碎片。将类器官混合物转移到与上述相同的管中。
11. 将类器官混合物在37℃水浴或heat block中孵育20分钟。取出，每隔5分钟将混合物上下吹打15-20次，以分解Matrigel® dome并将类器官解离成单细胞悬浮液。
    
    
    注意事项： 镜下检查细胞悬液是很有帮助的，以确保20分钟的消化后已经生成单细胞悬液。
12. 300 x g，离心5分钟。
13. 取出上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL DMEM + 1％BSA中。将细胞悬液使用细胞筛网（cell strainer）过滤。计数细胞。
14. 每个电穿孔反应准备1×10⁵细胞，300×g，离心5分钟。
15. 立即进入第四部分。

第四部分:制备电转所需的ArciTect™ CRISPR-Cas9 RNP Complex Mix

1. 要制备RNP Complex Mix，请按表2（Neon® Electroporation）或表3（Nucleofector™ X Electroporation）中列出的顺序在微量离心管中加入各组分。根据所需的转染次数调整各组分体积。
   
   

   表2. 使用sgRNA进行Neon®电穿孔的RNP Complex Mix的制备方法

   所含组分	Neon® Electroporation （每反应体积<μL>）
   重悬缓冲液R（Resuspension Buffer R）	6.00
   ArciTect™ Cas9 Nuclease (4 μg/μL; 25μM)*	0.90
   100 μM sgRNA	0.60
   总体积	7.50

   *如果使用3 μg/μL ArciTect™ Cas9-eGFP Nuclease，加入1.2 μL Cas9-eGFP和5.7 μL P3 Primary Cell Nucleofector™ Solution with Supplement 1。如果在一个实验中要使用两个或更多的gRNA（例如，如果使用ArciTect™ Cas9 Nickase<产品号 #76009>），请分别准备每份RNP Complex Mix。

   注意事项

   • 注意：不同的细胞系可能需要优化。推荐使用Cas9：gRNA的比例在A 1：2（表中所示）到1：8。
   • 这些值为单次电穿孔反应，包括Neon® electroporation的移液误差。根据需要扩大规模。

   
   
   

   表3. 使用sgRNA制备4D-Nucleofector™ X Electroporation的RNP Complex Mix

   所含组分	4D-Nucleofector™ X Electroporation （每反应体积<μL>）
   P3 Primary Cell Nucleofector™ Solution with Supplement 1	6.00
   ArciTect™ Cas9 Nuclease (4 μg/μL; 25μM)*	0.90
   100 μM sgRNA	0.60
   总体积	7.50

   *如果使用3 μg/μL ArciTect™ Cas9-eGFP Nuclease，加入1.2 μL Cas9-eGFP和5.7 μL P3 Primary Cell Nucleofector™ Solution with Supplement 1。如果在一个实验中要使用两个或更多的gRNA（例如，如果使用ArciTect™ Cas9 Nickase<产品号 #76009>），请分别准备每份RNP Complex Mix。

   Notes:

   • 注意：不同的细胞系可能需要优化。推荐使用Cas9：gRNA的比例在A 1：2（表中所示）到1：8。
   • 这些值为单次电穿孔反应，包括4D-Nucleofector™ X electroporation的移液误差。根据需要扩大规模。
2. 完全混匀。
3. 室温（15 - 25°C）孵育RNP Complex Mix 10-20分钟。

第五部分:对肠道干细胞和RNP复合物（RNP Complex）进行电穿孔

使用Neon® Transfection System（a部分）或Lonza® 4D-Nucleofector™ X Unit（b部分）进行电穿孔。

a) 使用Neon®转染系统进行电穿孔。

1. 吸取细胞沉淀中的上清液（在第三部分中制备）。将细胞重悬于7.5μL的Resuspension Buffer T中，使用移液枪剧烈混合。
2. 使用移液枪将7.5μL的细胞悬浮液与7.5μL的RNP Complex Mix（在第四部分中制备）轻轻混合，尽量不要生成气泡。
3. 使用10 μL Neon®枪头，吸取10 μL混合物，检查管中是否有气泡，放入具有3 mL电解缓冲液E（Electrolytic Buffer E）的电转室中。
   
   
   注意事项： 如果有气泡，电转时细胞的活力和转染效率会显著下降。
4. 使用表6中的设置对混合物进行电转
   
   
   注意事项： 参考电转仪器生产商的说明书。针对不同的细胞系可能需要进行电转条件的优化。

   表4. 使用Neon® Transfection System进行肠细胞电穿孔的推荐条件。

   电穿孔参数
   电压	1600 V
   脉冲宽度	20 ms
   脉冲数	2

b) 使用 Lonza® 4D-Nucleofector™ X Unit进行电穿孔

1. 吸取细胞沉淀中的上清液（在第三部分中制备）。将细胞重悬于17.5μL的P3 Primary Cell Nucleofector™ Solution + Supplement 1中，使用移液枪上下剧烈吹打均匀。
2. 将17.5μL的细胞悬浮液加入7.5μL的RNP Complex Mix（在第四部分中制备）中，使用移液枪轻轻吹打均匀，尽量不要形成气泡。
   
   
   注意事项： 注意：如果有气泡，电转时细胞的活力和转染效率会显著下降。
3. 将25 μL的细胞悬浮液+RNP Complex Mix转移至16-well Nucleocuvette™ Strip的一个孔。轻轻拍打或使用枪尖，以确保没有气泡存在。
4. 将 Lonza® 4D-Nucleofector™ X Unit设置为程序代码 DS-138。
5. 将Nucleocuvette™ Strip放入4D-Nucleofector™ X Unit中，选择 "确定 "加载条带，并选择 "开始 "开始电穿孔。

第六部分:编辑后培养

1. 电穿孔后，立即将细胞转移到一个不含DNase和RNase的微量离心管中。300 x g，离心5分钟。
2. 取出上清液，将细胞重悬在25 μL冷的DMEM + 1％BSA中。移液枪上下大力吹打10次，彻底重悬单细胞悬液。注意不要产生气泡。置于冰上。
3. 在样品管中加入25μL Matrigel®。使用移液枪上下混合。避免产生气泡。铺板前将细胞置于冰上。
4. 过夜预热24孔tissue culture-treated培养板，至少预热1至2小时。
5. 使用预先润湿的移液枪吸头，吸取50 μL的Matrigel®细胞悬浮液，并加入到24-well tissue culture-treated的培养板的1个孔中，具体如下：
   
   a. 将移液枪垂直于培养孔的中心。将移液枪枪头靠近但不接触孔底。
   
   b. 轻轻按压，直到在移液枪吸头的末端可见一滴水珠。
   
   c. 缓慢降低移液枪，直到液滴触及孔底。
   
   d. 轻轻地按压（仅到移液枪上的第一档）剩余的体积，同时抬起移液枪远离培养孔。
   
   
   注意事项： 迅速将Matrigel®细胞悬浮液从冰中取出，60秒内进行铺板。
6. 小心地将培养板转移到37℃培养箱中。孵化10分钟，让圆顶凝固。不要打扰圆顶。
7. 添加750 μL完整的IntestiCult™类器官生长培养基（添加有10μM Y-27632<最终浓度>）到每个孔中，沿培养孔壁加入培养基。不要将培养基从dome上直接加入。
8. 添加无菌PBS到未使用的培养孔中，以保持潮湿的环境。盖好盖子，于37°C，5% CO₂中培养。
9. 每隔2天，用完整的IntestiCult™类器官生长培养基进行全换液。
10. 收集细胞，评估后7 - 10天后的基因组编辑效率。
    
    
    注意事项： 可使用ArciTect™高保真DNA聚合酶试剂盒（ArciTect™ High-Fidelity DNA Polymerase Kit，产品号#76026）和针对靶点区域附近的引物对基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增后的产物进行测序。或者，可以使用ArciTect™T7核酸内切酶I试剂盒（ArciTect™ T7 Endonuclease I Kit ，产品号#76021）对经PCR扩增后的产物进行编辑效率（% INDEL形成率）的评估。

数据