以下操作步骤可用于对小鼠骨髓细胞进行分离、制备以及染色，以用于流式分析。

实验材料

• 小鼠的股骨和胫骨
• 磷酸盐溶液（不含Mg²⁺和Ca²⁺）（产品号 #37350），并添加5 mM EDTA和1%胎牛血清
• 21 - 26G针头
• 1 - 10 mL注射器
• 氯化钠溶液（产品号 #07800）
• 70 μm过滤器
• 抗小鼠CD16/CD32抗体，克隆号2.4G2（产品号 #60161）
• 7-AAD（产品号 #75001）

实验步骤

1. 使用1 - 3 mL添加有5 mM EDTA和1%胎牛血清的磷酸盐溶液PBS（不含Mg²⁺和Ca²⁺）冲洗骨头，从小鼠的股骨和胫骨分离细胞。冲洗过程可通过将21 - 26G针头连接到1 - 10 mL注射器上进行。
2. 使用针头温和地研磨细胞直至没有大的细胞团块，以制备单细胞悬液。
3. 在骨髓细胞中加入冷的氯化铵溶液，并在冰上孵育10分钟以裂解红细胞（RBCs）。
4. 裂解RBC后，用适当体积的PBS或类似缓冲液补足样本，室温下（15 - 25℃），300×g，离心5分钟。在PBS中重悬细胞，接着使用70 μm的过滤器进行过滤，以去除聚集的细胞团块和碎片。
5. 对过滤后悬浮液中的细胞进行计数，并在相同溶液中将其稀释至1 x 10⁷ cells/mL。从正常雄性C57Bl/6小鼠的胫骨和股骨（即4根长骨）中得到的有核细胞的预期回收率约为 4 - 5 x 10⁷细胞。
6. 为了减少荧光抗体的非特异性结合，通过用抗CD16/32（克隆号2.4G2）抗体和10％大鼠血清在冰上孵育细胞10分钟来阻断F_c受体。
7. 对于单抗染色的对照组，每管中加入3 × 10⁴个细胞，并通过总体积为100 μL的已优化浓度的单抗进行染色。
8. 同时，设置FMOs，在每管中加入2 - 3 x 10⁶ 细胞并使用已优化浓度的抗体进行染色以测试样本。
9. 在冰上孵育细胞，20分钟，避光。
10. 用适当体积的PBS洗涤细胞，室温下，300×g，离心5分钟，吸出上清液。
11. 在100 μL PBS中重悬细胞。
12. 流式分析前，向所有样本中添加1 μg/ mL 7-AAD，未染色、单抗染色和7-AAD-FMO对照除外。如果有许多死细胞或凋亡细胞，可能会导致自发荧光或非特异性染色增加，则应考虑将7-AAD加入单独的未染色和单抗染色的对照中。
    
    
    注意：该步骤中使用的是7-AAD来检测没有活性的细胞，但也可使用其它活细胞染料如碘化丙啶（PI）或胺反应染料。
13. 如果使用补偿磁珠，根据供应商的操作说明对对照组进行染色。为了获得最佳的荧光信号，对抗体进行滴定使其达到最高的染色指数非常重要。