EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
使用StemSpan™白血病细胞培养试剂盒进行体外药物筛选
使用StemSpan™白血病细胞培养试剂盒进行体外药物筛选
- Document # 27166
- Version 1.0.1
- 5/1/23
本技术公告介绍了使用无血清的StemSpan™的培养基和添加剂来对从 慢性髓性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）和急性髓性白血病 （acute myeloid leukemia，AML）患者中分离而得的造血干细胞和祖细 胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）进行新药药效检 测的方法。
StemSpan™应用于药物筛选的优势
- 对CD34+白血病细胞的扩增及维持培养进行优化。
- 可以采用流式细胞仪（flow cytometry）或者酶 标仪（plate reader）等多种读数方式，能够定量细胞的增 殖。
- 相比于CFU试验，提供更快（<7天）更简便的读 数流程。
- 经验证，能够获得与CFU试验（现行体外血 液毒性检测的标准检测方式）等效的50%抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）。
背景介绍
尽管癌症的诊断和治疗已经取得了长足的进步，可这些治疗手段对白血病 干细胞和祖细胞的效果仍然不甚理想。因此，寻找能够靶向抑制白血病 干细胞（Leukemic stem cells，LSCs）的新疗法成为当今白血病研究的重 中之重。
在液相培养体系中筛选有效的白血病新药通常是其药物研究的第一步1,2。研究发现，从CML和AML患者中分离而得的原代细胞比体外细胞系更能 体现白血病细胞在生物体内的复杂性。因此，原代细胞非常适合作为药物 筛选研究的模型3,4，来评估药物的临床效果。然而，患者样本的稀缺导致 无法获得足够数量的原代细胞成为了临床前药筛实验的掣肘。
本操作流程提供的药物筛选实验使用了StemSpan™白血病细胞培养试剂 盒（产品号 #09720），能够扩增并维持培养CD34+ 的CML或AML细胞。 这种基于液相培养体系的细胞毒性测定法可用于起始细胞数低的原始 样品，评估药物对LSCs的杀灭效果。该操作流程也可以应用于健康骨髓 （bone marrow，BM）或脐带血（umbilical cord blood，CB），评估候选 药物的毒性和特异性。此外，该操作流程也可以对特定患者样本进行药效 评估，为患者设计个性化治疗方案。
本药物筛选试验选用96孔培养板，可以提供定量，稳定和高通量的实验 结果。此外，类似于lineage-specific HemaTox™（产品号 #09704）试验， 本试验获得的实验结果与CFU试验所获得的实验结果存在相关关系3。尽 管使用体外CFU试验来测定药物的药效和毒性更为普遍，本文讲述的基 于液相培养体系的测定方法依旧有许多优势，包括实验周期更短，操作 更简单，读数方式更灵活。这就让实验人员可以加快药物筛选的速度，更 高效地找到候选药物小分子，然后专注于长期培养起始细胞（long-term culture-initiating cell，LTC-IC）试验或者临床前动物试验这类昂贵且耗时 的实验。
体外药物筛选试验所需培养基和添加剂
本文所述的实验使用StemSpan™白血病细胞培养试剂盒，包含StemSpan™ SFEM II （产品号 #09605），StemSpan™ CD34+扩增添加剂（产品号 #02691），以及小分子UM729（产品号 #72332）。
其他培养基和添加剂，例如，StemSpan™ SFEM（产品号 #09600）， StemSpan™ CC100（产品号 #02690）或CC110（产品号 #02697），以及小 分子UM171也可用于构建相似的培养环境。
需要了解更多使用StemSpan™培养基培养CD34+CML或AML细胞的信息， 请参考技术公告：Culturing Leukemic Stem and Progenitor Cells with StemSpan™ Medium（文档号 #27105）。
图1. 细胞毒性试验常规流程
使用EasySep™人脐带血CD34正选试剂盒II (Catalog #17896)**从（CML或AML）患者的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）或骨髓单核细胞 （bone marrow mononuclear cells，BMMCs）中分离收集CD34+ 细胞。使用StemSpan™白血病细胞培养试剂盒培养7-14天扩增细胞。 随后将扩增/未扩增的细胞培养于96孔 培养板内，加入实验组化合物或对照组化合物，37℃孵育7天，然后使用流式细胞仪或者其他方法测定IC50。
* 以下实验使用的是冻存细胞，新鲜细胞的实验结果应该类似。
**The EasySep™人脐带血CD34正选试剂盒II（产品号 #17896）理论上应用于新鲜脐带血样本，但是应用于本操作流程中，从CML或AML样本来源的新鲜/冻存的PBMCs或BMMCs中分选CD34+ 细胞，也可以获 得非常不错的纯度。
体外药物筛选试验的方法
扩增/未扩增的CD34+或AML细胞均可用于药物筛选，评估化合物对白血病细胞生长和增殖的影响。实验结果分析可选用自动细胞计数 （automated cell counting），酶标仪细胞计数（plate reader-based cell counting），或者对使用流式细胞仪对标记（例，7-AAD-，CD45+，或CD34+细胞）细胞进行绝对计数（absolute cell counting of labeled cells）。需要了解详细实验操作流程，请至官网www.stemcell.com，参考StemSpan™ 白血病细胞培养试剂盒的产品信息（product infomation sheet，PIS）（文档号 #10000003537）。
- 按照PIS（文档号 #10000003537）所述，准备StemSpan™白血病 细胞培养基。
- 使用适当的溶剂配制实验组化合物溶液，这是该化合物母液。请 至少按照该化合物在培养基中浓度的1000X进行制备。
- 制备2X化合物溶液，用StemSpan™白血病细胞培养基稀释化合 物母液（步骤2制备）。
- 制备2X对照组溶液，用StemSpan™白血病细胞培养基稀释对照 溶剂。
- 按照PIS，准备扩增/未扩增的的+CML或AML细胞。
- 制备细胞悬液，在即将接种细胞前，用StemSpan™白血病细胞培 养基稀释细胞，至终浓度为1000-8000个CD34+CML或AML细 胞/100 μL（10,000-80,000 细胞/mL）。
- 准备96孔平底培养板，每孔加入100 μL细胞悬液（步骤6制备）。
- 在孔中按需加入100 μL 2X化合物溶液或2X对照组溶液，轻轻吹 打混匀。
- 将96孔培养板放置于正方形培养皿（产品号 #38039）中，并用4 x 35 mm装有无菌水的培养皿（产品号 #27100）包围。
- 37℃，5% CO2，湿度>95%，孵育7天。
- 按需标记细胞表面标志物（例，对HSPC标记CD34和/或CD45）以 便用流式细胞仪对细胞进行表型分析。也可以使用ALDEFLUOR™ 试验对细胞做一个平行染色实验。需要了解更多标记细胞的详细 内容请参考PIS（文档号 #10000003537）。
- 用流式细胞仪进行分析。
分析
使用者可以选择适合的读数方式来检测化合物对CD34+CML或AML细胞增殖的影响。 推荐的方法包括对细胞进行谱系特异性（lineagespecific）细胞表面标志物染色，并使用具有绝对细胞计数能力的流式细胞仪对表达这些标志物的细胞进行计数。这使得使用者能够量化实验结果 并评估每种测试化合物的50％抑制浓度和90％抑制浓度（IC90）。也可以使用其他读数方式（例，自动细胞计数，图像细胞仪计数，或酶标仪细胞计 数）进行细胞计数，但可能需要进一步优化这些计数方法。
图2. 使用StemSpan™白血病细胞培养基对CML细胞进行药物筛选试验
CD34+CML细胞在StemSpan™白血病细胞培养基中用伊马替尼（imatinib，IM，产 品号 ＃72532）和达沙替尼（dasatinib，DA，产品号 ＃73082）处理7天。每两天用 高分辨率成像系统对细胞进行记录以监控细胞的生长，第7天收获细胞，用流式细 胞仪计数细胞数量以测定IC 50。（A）加入IM和DA，浓度从低到高，每组3个复孔，7 天后（未扩增）细胞的代表性图像。绿色为细胞呈低浓度分布，红色为细胞呈高浓 度分布。（B）加入IM和DA之后，使用成像系统及其细胞密度算法，每两天对细胞进 行一次成像分析，生成的（未扩增）细胞生长曲线。（C）使用流式细胞仪在加药7天 后分析7-AAD -细胞所得的数据，生成未扩增，7天扩增，14天扩增细胞的剂量反应 曲线（Dose-response curves）。用药组细胞数量根据对照组的细胞数量做了标准 化处理。IM和DA对CD34 +CML细胞的抑制效果与用药浓度和培养时间相关。扩增/ 未扩增的 +CML细胞都能够生成剂量反应曲线来测定IC 50。IM和DA的IC50分 别为4.1 nM与0.37 μM。注：7天扩增，14天扩增的CML细胞都带有BCR-ABL基因， 由单集落qPCR（single colony qPCR）验证发现与未扩增CML细胞的BCR-ABL丰度 （frequency）相似（ 参考文档号 #27105）。
图3. 使用StemSpan™白血病细胞培养基对AML细胞进行药物筛选试验
CD34+CML细胞在StemSpan™白血病细胞培养基中用阿霉素（doxorubicin，DOX） 和阿扎胞苷（azacitidine，AZA）处理7天。每两天用高分辨率成像系统对细胞进行记 录以监控细胞的生长，第7天收获细胞，用流式细胞仪计数细胞数量以测定IC 50。（A） 加入DOX和AZA，浓度从低到高，每组2个复孔，7天后（扩增）细胞的代表性图像。绿 色为细胞呈低浓度分布，红色为细胞呈高浓度分布。（B）加入DOX和AZA之后，使用 成像系统及其细胞密度算法，每两天对细胞进行一次成像分析，生成的（7天扩增）细 胞生长曲线。（C）使用流式细胞仪在加药7天后分析7-AAD -细胞所得的数据，生成7 天扩增，14天扩增细胞的剂量反应曲线。用药组细胞数量根据对照组的细胞数量做 了标准化处理。DOX和AZA对CD34 +AML细胞的抑制效果与用药浓度和培养时间相 关。扩增/未扩增CD34 +AML细胞都能够生成剂量反应曲线来测定IC 50。IDOX和AZA 的50分别为5.5 nM 与0.41 μM。
图4. CFU试验与96孔板液相培养细胞毒性试验测得的IC50之间的相关性分析
同时使用MethoCult™ H4435 enriched medium的CFU试验与StemSpan™白血病细胞 培养基的液相体系细胞毒性试验测定四种药对扩增/未扩增的CML，AML和CB CD34+ 细 胞的影响：DOX（绿色），AZA（蓝色），IM（红色），DA（黑色）。AML细胞用DOX和AZA 处理；CML细胞用IM和DA处理。CB细胞用DOX，AZA，IM和DA处理。CFU试验与液相体 系细胞毒性试验都显示扩增/未扩增细胞的抑制效果与用药浓度和培养时间相关。将两 种试验方法所得的IC50绘制于坐标系中，相关系数（correlation coefficient，r）为0.82，P 值（P-value）<0.0001。
本技术公告中使用小分子为UM171。STEMCELL Technologies不再提供该产品的销售，使用1 μM的 UM729，也可以获得相似的试验结果。
欲了解包括UM171和UM729的数据比较在内的更多信息，请参见Fares et al. 2014。
产品信息
CD34+CML或AML细胞的分离与培养
*使用175 mM的U171，可以获得相似的试验结果。
实验结果分析
*（图4）流式细胞仪所用到的CD90 PE-Cy7和CD45RA APC-Cy7抗体，系从其他供应商处获取。
参考文献
- Lai D et al. (2018) PP2A inhibition sensitizes cancer stem cells to ABL tyrosine kinase inhibitors in BCR-ABL+ human leukemia. Science Translational Medicine 10(427).
- Minzel W et al. (2018) Small molecules co-targeting CKIα and the transcriptional kinases CDK7/9 control AML in preclinical models. Cell 175(1): 171-185.
- Uppal H et al. (2015) Potential mechanisms for thrombocytopenia development with trastuzumab emtansine (T-DM1). Clinical Cancer Research 21(1): 123–133.
- Xing et al. (2012) Selective small molecule inhibitors of p110α and δ isoforms of phosphoinosityl-3-kinase are cytotoxic to human acute myeloid leukemia progenitors. Experimental Hematology 40(11): 922-933.
- Fares I et al. (2014) Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science 345(6203): 1509–1512.
沪公网安备31010102008431号